貴州省小麥品種（系）中與籽粒硬度相關(guān)基因的分子檢測(cè)

楊夢(mèng)晨 晏權(quán) 任明見 李魯華 徐如宏

摘 要：小麥Puroindoline基因與小麥籽粒硬度及其產(chǎn)量性狀密切相關(guān)。為揭示貴州省小麥品種（系）中與籽粒硬度相關(guān)基因的分布，本文利用小麥籽粒硬度基因Pina、Pinb和Pinb-2的3個(gè)特異性功能標(biāo)記對(duì)140份小麥品種（系）進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，旨在為遺傳育種中親本選擇提供參考。結(jié)果表明，在140份貴州小麥品種（系）中，Pina-D1和Pinb-D1基因位點(diǎn)Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a和Pinb-D1b等位變異的頻率分別為17.14%、25.00%、50.71%和21.43%;在Pinb-2位點(diǎn)上，10.00%的小麥品種含Pinb-2v2等位基因，87.86%的小麥品種含Pinb-2v3等位基因。3個(gè)位點(diǎn)基因型組合分析表明，在所檢測(cè)的貴州小麥種質(zhì)中共有8種基因型組合，其中2種軟質(zhì)麥基因型組合Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3;4種硬質(zhì)麥基因型組合（Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3和2種混合型組合Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3），各組合分布頻率分別為0.71%、8.57%、0.71%、4.28%、3.57%、7.85%、0.71%和2.14%。研究結(jié)果可為貴州小麥籽粒硬度的遺傳改良提供參考。

關(guān)鍵詞：小麥;籽粒硬度;等位變異;分子標(biāo)記

Abstract：Puroindoline gene was closely related to the kernel hardness and yield-related traits in wheat. In order to reveal the distribution of genes related to grain hardness in wheat cultivars （lines） in Guizhou Province， In this paper， specific function of three kernel gene Pina， Pinb and Pinb-2 markers was identified with molecular marker in total of 140 cultivars （lines）in order to provide reference for parent selection in genetic breeding. The results demonstrated that among the 140 wheatcultivars （lines） in Guizhou， the frequency of Pina-D1 and Pinb-D1 gene locus Pina-D1a， Pina-D1b， Pinb-D1a and Pinb-D1b alleles were 17.14% ，25.00%， 50.71% and 21.43%， respectively.At the Pinb-2 locus， 10.00% of the wheat cultivars contain the Pinb-2v2 allele， and 87.86% of the wheat cultivars contain the Pinb-2v3 allele. The analysis of genotype combinations at three locus showed that there were? eight genotype combinations in the tested wheat germplasm in Guizhou，including two soft wheat genotype combinations? （Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2，Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3），four hard wheat genotype combinations （Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2，Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3，Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2，Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3） and two hybrid combinations （Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2，Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3），the distribution frequency of each combination is 0.71%，8.57%， 0.71%，4.28%，3.57%，7.85%，0.71% and 2.14%. The results could provide a reference for genetic improvement of grain hardness in Guizhou wheat.

Keywords：Guizhou wheat; grain hardness; allelic variation; molecular markers

目前，全球每年的小麥（Ttiticnm aestivum L.）產(chǎn)量大約為700萬噸[1]。籽粒硬度是小麥重要品質(zhì)性狀之一[2]，根據(jù)小麥籽粒的硬度一般將小麥分為硬質(zhì)麥和軟質(zhì)麥兩類[3]。小麥籽粒硬度由位于5D染色體短臂上的Pina和Pinb基因[4-6]共同作用控制。當(dāng)Pina和Pinb同為野生型（Pina-D1a/Pinb-D1a）時(shí)，籽粒為柔軟表型，兩者任何一個(gè)基因發(fā)生突變或缺失都會(huì)使籽粒變硬[7]。早期Pina和Pinb的鑒定大多采用SDS-PAGE電泳[8]，但Pina和Pinb的同源性高（約60%），分子量非常接近，用SDS-PAGE電泳很難區(qū)分，因此國內(nèi)外學(xué)者相繼開發(fā)出了Pina和Pinb基因型的分子標(biāo)記，如Pina-D1a[9]、Pina-D1b[10]、Pinb-D1a和Pinb-D1b[11]等。陳鋒等[12]通過籽粒硬度測(cè)定，隨機(jī)選取了10個(gè)中國冬小麥軟質(zhì)麥品種進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果表明其Pina和Pinb基因均為野生型，即Pina-D1a/Pinb-D1a，基因型與表型相符，證明已開發(fā)的分型標(biāo)記可靠。王化敦等[13]測(cè)定了105份小麥的籽粒硬度，得出了40份硬質(zhì)麥，再通過分子標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們是Pina蛋白缺失類型（即Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1b/Pinb-D1b），證實(shí)了已開發(fā)的籽粒硬度基因分子標(biāo)記特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高。因此，上述研究中開發(fā)的功能標(biāo)記已經(jīng)能夠?qū)ina和Pinb的多種類型進(jìn)行有效鑒定。

近年來，與Pinb序列高度相似（約60%）的Pinb-like genes（也稱為Pinb-2）基因與表型的相關(guān)性成為了研究熱點(diǎn)[14]。Chen等[15]設(shè)計(jì)了Pinb-2的特異引物，得出Pinb-2v2和Pinb-2v3互為一對(duì)位于7B的等位基因。研究表明，Pinb-2v3變異類型的小麥品種在千粒重、小穗數(shù)、粒長、粒寬和等性狀略高于Pinb-2v2[16];具Pinb-2v3的小麥品種與具有Pinb-2v2的小麥品種相比，有更高的籽粒硬度和更好的籽粒性狀[17]。

目前，對(duì)貴州小麥材料Pina、Pinb、Pinb-b2基因分布的研究未有報(bào)道，鑒于Puroindoline基因與小麥品質(zhì)性狀和產(chǎn)量性狀密切相關(guān)，且目前已開發(fā)的功能標(biāo)記已經(jīng)能夠?qū)uroindoline各類型進(jìn)行有效鑒定。本研究以3個(gè)籽粒硬度基因（Pina、Pinb和Pinb-b2）的特異性功能標(biāo)記對(duì)140份貴州小麥品種（系）進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測(cè)，旨在為今后研究不同Puroindoline基因型對(duì)小麥加工品質(zhì)的影響作用提供依據(jù)，進(jìn)而有助于貴州小麥籽粒硬度的改良。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：貴紫1號(hào)、貴農(nóng)19、貴綠、黔育21、貴麥14、興育89等140份貴州小麥品種（系），由國家小麥改良中心貴州分中心提供。材料名稱及來源見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取小麥幼苗葉片0.2g左右，采用改良CTAB法提取基因組DNA[18]。用Genova Nano型核酸蛋白檢測(cè)儀（英國Jenway）檢測(cè)DNA濃度后，稀釋至100ng/μL，在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

提取后的基因組DNA在BIO-RAD T100_Thermal Cycler上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，以100ng小麥材料DNA為模板，1UTaq DNA Polymerase，10pmol的上游、下游引物，0.2mmol/L dNTP，10×PCRBuffer（含20mmol/L Tris-HCL（pH8.4）、20mmol/LKCL），25mmol/LMgCl2，剩下的用ddH2O補(bǔ)充至20μL。試驗(yàn)所需試劑購置于北京天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)特異性引物的序列及具體反應(yīng)程序見表2。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及結(jié)果統(tǒng)計(jì)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析，所用緩沖溶液為0.5×TAE，在100～130V電壓下電泳40～50min，用蒸餾水漂洗1min后，用UVP凝膠分析系統(tǒng)觀察、照相并記錄。

統(tǒng)計(jì)方法：根據(jù)每個(gè)材料的檢測(cè)結(jié)果判斷該品種Pina、Pinb和Pinb-2基因位點(diǎn)的等位變異類型，僅對(duì)PCR產(chǎn)物條帶清晰、單一并符合目標(biāo)條帶大小的對(duì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州小麥品種（系）Pina基因等位變異分布頻率

利用引物Pina-D1a和A-Null對(duì)供試小麥材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，分別能擴(kuò)增出大小為447bp和326bp的片段，對(duì)應(yīng)的等位變異類型為Pina-D1a和Pina-D1b（圖1、2）。140份貴州小麥材料Pina位點(diǎn)的檢測(cè)表明（表3），分枝麥5號(hào)、貴麥2號(hào)、豐優(yōu)48-5、貴農(nóng)優(yōu)質(zhì)麥、節(jié)普1號(hào)等24份材料擴(kuò)增出447bp的目標(biāo)條帶，是Pina-D1a類型等位變異;貴紫1號(hào)、興育89、貴麥1號(hào)、R21-2等35份材料擴(kuò)增出326bp的目標(biāo)條帶，是Pina-D1b類型等位變異;其他材料未擴(kuò)增出任何條帶，即未含Pina-D1a和Pina-D1b基因的類型。在Pina位點(diǎn)，140份貴州小麥品種（系）中的優(yōu)勢(shì)等位變異為Pina-D1a類型，占比25.00%。

2.2 貴州小麥品種（系）Pinb基因等位變異分布頻率

利用引物Gly和Ser對(duì)供試小麥材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，均能擴(kuò)增出大小為240bp的片段，對(duì)應(yīng)的等位變異類型為Pinb-D1a和Pinb-D1b（圖3、4）。140份貴州小麥材料Pinb位點(diǎn)的檢測(cè)表明（表3），豐優(yōu)5號(hào)、貴農(nóng)19無芒、豐優(yōu)48-5、貴農(nóng)28-1、等71份材料擴(kuò)增出240bp的目標(biāo)條帶，是Pina-D1a類型等位變異;貴麥9號(hào)、貴麥2號(hào)、貴農(nóng)25-1、安2014-4等30份材料擴(kuò)增出240bp的目標(biāo)條帶，是Pinb-D1b類型等位變異;其他材料未擴(kuò)增出任何條帶，即未含Pinb-D1a和Pinb-D1b基因的類型。在Pinb位點(diǎn)，140份貴州小麥品種（系）中的優(yōu)勢(shì)等位變異為Pinb-D1a類型，占比50.71%。

2.3 貴州小麥品種（系）Pinb-2基因等位變異分布頻率

利用引物Pinb-2v2和Pinb-2v3對(duì)供試小麥材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，分別能擴(kuò)增出大小為401bp和398bp的片段，對(duì)應(yīng)的等位變異類型為Pinb-2v2和Pinb-2v3（圖5、6）。140份貴州小麥材料Pinb-2位點(diǎn)的檢測(cè)表明（表3），豐優(yōu)5號(hào)、豐優(yōu)8號(hào)、貴農(nóng)25-1、興育89等14份材料擴(kuò)增出401bp的目標(biāo)條帶，是Pinb-2v2類型等位變異;貴農(nóng)35、石無芒、張07-8、貴農(nóng)22等123份材料擴(kuò)增出398bp的目標(biāo)條帶，是Pinb-2v3類型等位變異;其他材料未擴(kuò)增出任何條帶，即未含Pinb-2v2和Pinb-2v3基因的類型。在Pinb-2位點(diǎn)，140份貴州小麥品種（系）中的優(yōu)勢(shì)等位變異為Pinb-2v3類型，占比87.86%。

2.4 貴州小麥品種（系）Pina、Pinb和Pinb-2多個(gè)位點(diǎn)等位變異分布頻率

在140份貴州小麥品種（系）中，Pina、Pinb和Pinb-2基因位點(diǎn)Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a、Pinb-D1b、Pinb-2v2和Pinb-2v3等位變異的頻率分別為17.14%，25.00%，50.71%，21.43%，10.00%和87.86%。組合分析表明，140份貴州小麥品種（系）中共存在8種不同等位變異組合，即Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v2、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v2、Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v2和Pina-D1b/Pinb-D1b/Pinb-2v3，分布頻率分別為0.71%，8.57%，0.71%，4.28%，3.57%，7.85%，0.71%和2.14%（表4）。

3 結(jié)論與討論

小麥籽粒硬度對(duì)出粉率、面粉顆粒大小和面制品加工品質(zhì)影響很大，是重要的小麥品質(zhì)性狀之一[20]，明確小麥籽粒硬度基因Pina、Pinb和Pinb-2的等位變異類型分布特點(diǎn)，對(duì)于小麥品質(zhì)改良具有重要意義。劉紅美[21]、張晶[22]等發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)小麥核心種質(zhì)和陜西小麥中的軟質(zhì)麥占比較低，硬質(zhì)麥占比較高，硬質(zhì)麥主要由Pinb-D1b基因型組成;國外的小麥品種（系）也以硬質(zhì)麥為主[23-24]。而陳鋒等[25]發(fā)現(xiàn)硬質(zhì)小麥材料在西南地區(qū)的分布頻率較低，李式昭等[26]的研究也表明，四川小麥品種中硬質(zhì)麥占比較少。經(jīng)檢測(cè)，本試驗(yàn)140份供試的小麥品種（系）中Pina-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1a和Pinb-D1b等位變異的頻率分別為16.46%，25.32%，50.00%和21.52%，據(jù)此可分出籽粒硬質(zhì)33份，軟質(zhì)13份，表明貴州小麥品種（系）中20.89%為硬質(zhì)材料，8.23%為軟質(zhì)品種。其中，籽粒硬質(zhì)及軟質(zhì)的小麥品種都較少，這一點(diǎn)與黃淮麥區(qū)和國外小麥的研究結(jié)果不同，與李式昭和陳鋒等[26-27]的研究基本一致，小麥品種籽粒硬度分布的差異可能是自然地理環(huán)境和選育品種所選用的親本資源不同所致。

Puroindoline基因的類似基因Pinb-2對(duì)食品加工品質(zhì)和產(chǎn)量性狀都有影響[27]。研究表明，具有Pinb-2v3等位變異類型的小麥品種其千粒重、籽粒直徑、穗粒數(shù)、穗粒重和單株粒重等產(chǎn)量性狀都較好[28]，且Pinb-2v3等位變異在國內(nèi)外小麥品種中分布廣泛[19，29，30]。本試驗(yàn)中，有124份材料檢測(cè)出了Pinb-2v3，占比88.61%，Pinb-2v3具有很高的分布頻率，與前人的研究一致。這可能是由于含Pinb-2v3的小麥材料其產(chǎn)量性狀表現(xiàn)較為優(yōu)異，育種家們?cè)谟N過程中不經(jīng)意的選擇了攜帶該基因的品種，致使大部分研究的調(diào)查品種中Pinb-2v3基因型最常見。對(duì)140份貴州小麥品種（系）的Pina、Pinb和Pinb-2多個(gè)位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行組合分析，得出2種軟質(zhì)麥基因型組合和4種硬質(zhì)麥基因型組合。值得注意的是，組合Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3和Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3，在140份供試材料中作為優(yōu)勢(shì)組合的同時(shí)還含有與高千粒重相關(guān)的Pinb-2v3基因，今后可優(yōu)先考慮利用具這些組合的材料進(jìn)行貴州小麥品質(zhì)育種的研究。

相較其他地區(qū)，貴州小麥品種（系）中，硬質(zhì)、軟質(zhì)以及與高千粒重相關(guān)的品種較少，這進(jìn)一步說明了貴州小麥品種在品質(zhì)改良方面還有很大的提升空間。因此，本研究明確了140份貴州小麥品種（系）籽粒硬度的基因型，可為今后這些貴州小麥品種（系）籽粒硬度的改良和產(chǎn)量的提高提供幫助。

參 考 文 獻(xiàn)：

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