腸道細菌對西花薊馬生長發(fā)育和繁殖的影響

葉佳琴 郅軍銳 黃宸

摘 要：西花薊馬是世界性入侵害蟲。為明確腸道細菌對西花薊馬生長發(fā)育及繁殖的影響，利用25mg/mL氨芐青霉素去除西花薊馬腸道細菌，觀察西花薊馬發(fā)育歷期以及繁殖的變化。結(jié)果表明;去除腸道細菌后F1代西花薊馬1齡若蟲和預(yù)蛹時發(fā)育時間明顯短于對照，2齡若蟲發(fā)育時間延長0.71d，未成熟期沒有顯著變化。去除腸道細菌后導(dǎo)致F0代西花薊馬產(chǎn)卵提前1.15d，雌成蟲壽命延長，產(chǎn)卵量比對照降低了25.53粒。去除腸道細菌后西花薊馬內(nèi)稟增長率rm和凈增值率R0降低，種群加倍時間t和平均世代周期T加長。結(jié)果證實腸道細菌對不同齡期的西花薊馬蟲態(tài)歷期有一定影響，但對未成熟期沒有明顯影響，對西花薊馬繁殖有一定的促進作用。

關(guān)鍵詞：西花薊馬;氨芐青霉素;腸道細菌;生長發(fā)育;產(chǎn)卵量

Abstract：Frankliniella occidentalis is a worldwide invasive pest. To determine the effect of gut bacteria on the growth， development and reproduction on F. occidentalis. Ampicillin （25mg/mL） was used to remove gut bacteria of F. occidentalis， and the effects were evaluated development and reproduction. The results showed that Ampicillin shorted the development time of first instar nymphs and pre-pupae and extended the development time of second instar nymph compared with the control group. And Ampicillin also shorted the oviposition period of F.occidentalis， extended the longevity of female adults and decreased the fecundity of F. occidentalis compared with the control group. After the removal of gut bacteria， the innate capacity of increase rm and net proliferation rate R0 were reduced， and the population doubling time t and the mean generation cycle T were prolonged. The results indicated that the gut bacteria in F. occidentalis had a certain effect on the development time of some stages and could promote the reproduction of F. occidentalis.

Keywords：Frankliniella occidentalis; Ampicillin; gut bacteria; growth and development

西花薊馬Frankliniella occidentalis （Pergande）作為一種外來入侵生物，已成為世界性重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物害蟲之一[1-2]，2003年在我國北京首次發(fā)現(xiàn)[3]，隨后在云南、山東、新疆等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重影響蔬菜、花卉產(chǎn)量和品質(zhì)，還可以通過傳播番茄斑萎病毒（TSWV）和鳳仙花壞死病毒（INSV）造成更為嚴(yán)重的危害[4-8]。西花薊馬體型小、繁殖快、隱蔽性強，極易產(chǎn)生抗藥性，使得對西花薊馬愈加難以防治[7]。

腸道微生物數(shù)量龐大，在宿主體內(nèi)起著重要作用，它們與昆蟲相互依賴，互惠共生[9-10]。同時腸道微生物在宿主營養(yǎng)吸收、發(fā)育繁殖、抵御病原菌、增強免疫力、代謝解毒以及抗藥性等方面起著重要作用[11]。昆蟲腸道微生物是一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，如果將其破壞，可對宿主產(chǎn)生不同程度影響[12-13]。近年來有很多關(guān)于腸道微生物被打亂后對宿主影響的研究。例如，在對于果蠅Drosophila melanogaster腸道微生物的研究中發(fā)現(xiàn)，用抗生素清除腸道細菌后會阻斷交配選擇[14];利用抗生素去除玉米根葉甲Diabrotica virgifera virgifera （LeConte）的腸道微生物后，會降低對大豆的取食性，造成發(fā)育時間延長[15];使用抗生素利福平清除B型煙粉虱Bemisia tabaci成蟲腸道細菌后，后代的發(fā)育時間和存活率明顯降低[16];使用土霉素處理黑豆蚜（Aphis craccivora）后使若蚜發(fā)育推遲，成蚜完全不能生育[17]。由此可見，抗生素清除腸道微生物是評價腸道菌功能的重要方法[13]。早期在對西花薊馬的腸道研究中通過直接顯微鏡觀察、傳統(tǒng)培養(yǎng)和API-20E腸道菌試劑鑒定條確定西花薊馬后腸內(nèi)存在大量的細菌[18]。前期試驗結(jié)果表明25mg/mL氨芐青霉素可有效去除西花薊馬的腸道可培養(yǎng)細菌。本文研究利用抗生素去除西花薊馬腸道細菌后，對西花薊馬發(fā)育歷期及繁殖的變化，以明確腸道細菌對西花薊馬生長發(fā)育和繁殖的影響，為進一步探索西花薊馬腸道細菌的功能提供一定的理論依據(jù)，為西花薊馬防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 抗生素

氨芐青霉素，購買于生工生物工程（上海）股份有限公司，化學(xué)純研究專用抗生素。

1.2 供試?yán)ハx和植物

供試?yán)ハx：西花薊馬，采自貴州省貴陽市花溪區(qū)周邊蔬菜上，并在試驗室人工氣候箱，溫度（25±1）℃，濕度65%～70%，光照周期14L：10D內(nèi)用菜豆豆莢長期飼養(yǎng)。

供試植物：矮生菜豆 Phaseolus vulgaris（泰國地豆王品種）種植在人工氣候箱中，溫度（25±1）℃，濕度65%～70%，光照周期14L：10D，以營養(yǎng)缽進行培育，菜豆長至兩片真葉后備用。菜豆植株生長期間未受到任何損害和病蟲害的危害。

1.3 試驗方法

選用25.00mg/mL氨芐青霉素去除西花薊馬腸道細菌后對其生長發(fā)育及產(chǎn)卵的影響，將培育菜豆葉片剪為1.5cm×1.5cm的正方形，用25mg/mL氨芐青霉素溶液浸泡10s后取出晾干后置于25mL圓柱形透明塑料盒（下底徑3.1cm，上口徑3.7cm，高3.3cm）中備用，以清水處理作為對照。將F0代西花薊馬2齡若蟲單頭挑至裝有對應(yīng)溶液浸泡過的菜豆葉片的塑料盒中，進行編號，隔12h觀察一次，每24h更換新鮮葉片，同時記錄若蟲的化蛹時間。待羽化成蟲立即進行配對，記錄成蟲存活情況;對成蟲進行配對后，每日取出被產(chǎn)卵葉片放入新準(zhǔn)備的塑料盒（規(guī)格同上）中，用直徑為2.5cm左右的圓形濕濾紙進行保濕，將剛孵化的F1代1齡若蟲單頭挑至塑料盒（規(guī)格同上）中，記錄1、2齡若蟲、預(yù)蛹和蛹期發(fā)育時間，成蟲羽化后記錄性比。以取食用清水處理的菜豆葉片作為對照（CK），試驗設(shè)置見表1。

1.4 生命表參數(shù)及計算公式

凈增殖率R0=Σlxmx;平均世代周期T=Σxlxmx/R0;內(nèi)稟增長率rm=lnR0/T;周限增長率λ=erm。式中x為按存活時間劃分的年齡，lx表示在x時期開始時的存活率，mx表示在x期間內(nèi)存活的平均每雌產(chǎn)雌數(shù)[19]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Office Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 21.0軟件根據(jù)數(shù)據(jù)使用獨立樣本t檢驗進行抗生素處理與對照之間的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道細菌對西花薊馬F1代生長發(fā)育的影響

腸道細菌的存在對西花薊馬發(fā)育歷期的影響明顯不同（表1）。去除腸道細菌使西花薊馬F1代1齡若蟲和預(yù)蛹期發(fā)育時間顯著縮短0.25d和0.22d，2齡若蟲發(fā)育時間較對照極顯著延長0.71d;不論西花薊馬是否含有腸道細菌，對蛹期都沒有明顯影響。對于未成熟期而言，去除腸道細菌后西花薊馬的發(fā)育歷期長于對照，但無顯著差異。

2.2 腸道細菌對西花薊馬存活率的影響

未去除腸道細菌的F1和F0代西花薊馬存活率在1～12d和12～25d逐漸下降在35d時存活率為0，去除腸道細菌的F0代西花薊馬存活率在18～29d明顯偏高，F(xiàn)1和F0代1～12d和12～25d時緩慢下降，在25～32d迅速下降，在32d時全部死亡。

2.3 腸道細菌對F0代西花薊馬雌蟲壽命及繁殖的影響

西花薊馬腸道細菌去除后對其繁殖有明顯影響（表 2）。不含腸道細菌的西花薊馬產(chǎn)卵前期較對照明顯提前了1.15d;西花薊馬腸道細菌使得雌成蟲壽命平均延長了2.13d。去除腸道細菌后雌成蟲產(chǎn)卵量較對照平均下降25.53粒。

2.4 腸道細菌對F0代西花薊馬在兩性生殖下生命表參數(shù)的影響

抗生素去除腸道細菌后對F0代西花薊馬的生命表參數(shù)有不同程度的影響（表 3）。去除腸道細菌后西花薊馬內(nèi)稟增長率rm和凈增值率R0降低，種群加倍時間t和平均世代周期T加長，周限增長率低于對照但無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

腸道微生物對宿主的生長繁殖和生理活動具有重要的作用，健康的菌群可以促進宿主的生長發(fā)育和繁殖，提高宿主的存活率[14]。前人通過傳統(tǒng)方法研究表明西花薊馬腸道內(nèi)含有大量細菌[19]，前期通過Illumina Miseq技術(shù)對西花薊馬腸道進行16S rDNA V3-V4可變區(qū)域進行測序證明存在大量細菌（未發(fā)表數(shù)據(jù)），西花薊馬通過取食獲得細菌，這些細菌對其產(chǎn)卵量增加和生長發(fā)育縮短[18]。本文選用25 mg/mL氨芐青霉素去除西花薊馬腸道細菌，發(fā)現(xiàn)1齡若蟲和預(yù)蛹發(fā)育時間短于含有腸道細菌的西花薊馬，該結(jié)果與有些昆蟲的發(fā)育情況相同。如在前人研究歐文氏菌與西花薊馬關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，以“葉片+花粉”飼喂西花薊馬1齡若蟲，發(fā)現(xiàn)不含歐文氏菌的西花薊馬發(fā)育歷期更短[20]。胡祖慶等[21]研究了胞內(nèi)共生菌對麥二叉蚜Schizaphis graminum （Rondani）生長發(fā)育和繁殖的影響發(fā)現(xiàn)，在高抗小麥品系35Q9上，含共生菌的麥二叉蚜若蟲發(fā)育歷期顯著短于不含共生菌的麥二叉蚜。對于西花薊馬2齡若蟲，去除腸道細菌后發(fā)育時間較含有腸道細菌顯著延長0.71d。沈金紅等[13]研究抗生素對小菜蛾P(guān)lutella xylostella生長發(fā)育影響時發(fā)現(xiàn)，無菌品系的小菜蛾幼蟲發(fā)育時間較含菌品系而言明顯延長;兜蝽科plataspid stinkbugs在不攜帶共生菌囊時，發(fā)育時間明顯長于攜帶共生菌囊的兜蝽[22]。

在其他昆蟲研究中，去除腸道細菌后幼/若蟲發(fā)育時間一致延長。如使用利福平處理Q型煙粉虱后，煙粉虱卵期、若蟲期及偽蛹期的發(fā)育歷期均有所延長，整個未成熟期也較無共生菌Cardinium煙粉虱顯著延長[23]。但在研究西花薊馬腸道細菌去除時卻不同，子代F1的1齡若蟲和預(yù)蛹發(fā)育時間顯著短于對照，2齡若蟲發(fā)育時間顯著長于對照，而整個未成熟期與對照無顯著差異。在使用10μg/mg抗生素去除麥扁盾蝽Eurygaster integriceps Puton腸道細菌后，麥扁盾蝽1齡若蟲發(fā)育時間顯著短于對照，2齡時顯著長于對照，其他齡期與對照無差異，但整個未成熟期顯著長于對照[24]。這可能與昆蟲所取食食物相關(guān)，在研究西花薊馬生長發(fā)育與食物關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)∈滁S瓜葉片或豆葉的生長發(fā)育時間往往長于取食添加花粉或是“花粉+蜂蜜”的食料[25-26];前人在研究昆蟲與寄主攝食效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，單純飼喂西花薊馬黃瓜葉片時，含細菌西花薊馬若蟲發(fā)育時間短于無菌若蟲，但以“葉片+花粉”飼喂西花薊馬時結(jié)果相反，含菌西花薊馬若蟲發(fā)育時間長于無菌若蟲[20]。

去除西花薊馬腸道細菌后其產(chǎn)卵時間平均提前1.15 d，產(chǎn)卵量較對照而言平均降低了25.53粒，但雌成蟲壽命延長。這與DE VRIES等[20]研究類似，取食黃瓜葉后無菌西花薊馬產(chǎn)卵量低于含有歐文氏菌的西花薊馬;在對美棘薊馬Echinothrips americanus Morgan研究中發(fā)現(xiàn)，去除Wolbachia后薊馬雌成蟲壽命延長[28];在柑橘大實蠅Bactrocera minax研究中，慶大霉素gentamicin和鏈霉素streptomycin去除其腸道共生菌后，雌成蟲的壽命增加，繁殖力降低[29]。但也有不同的報道，如抗生素處理FZss品系小菜蛾導(dǎo)致了小菜蛾產(chǎn)卵量和成蟲壽命降低[13]。成蟲壽命變化和產(chǎn)卵量下降與腸道細菌作用有關(guān)，昆蟲腸道細菌在昆蟲生長發(fā)育和繁殖中起著重要的作用，它們可以參與宿主食物消化、提供營養(yǎng)、合成維生素和甾醇類物質(zhì)等，甚至可以改變植食性昆蟲對寄主植物的利用[30-32]，從而影響昆蟲的發(fā)育、生長和繁殖[33-36]。

本文研究表明，抗生素去除腸道細菌后可影響西花薊馬生長發(fā)育和繁殖，這為進一步揭示西花薊馬的腸道細菌的具體功能奠定了基礎(chǔ)。

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