高脂血癥大鼠血液中氨基酸代謝標志物分析

江潔怡 肖觀林 曾志浩 蔡大可

1 廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室(廣州 510095)

2 廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院(廣州 510405)

高脂血癥(hyperlipidemia)是指血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和/或低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過高和/或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過低的一種全身脂代謝異常疾病，也稱血脂異常[1]。高脂血癥作為內分泌系統(tǒng)疾病，其病癥的發(fā)生與機體內器官的代謝問題有關，如內環(huán)境失衡、微生態(tài)調節(jié)等，但目前臨床上對高脂血癥的檢測仍主要停留在 “血脂”這一實驗室指標上，而忽略了其伴隨的其它病理生理的改變。事實上，在高脂血癥發(fā)病過程中，不僅會出現(xiàn)脂代謝的紊亂，還會出現(xiàn)糖代謝、氨基酸代謝、氧化應激及炎癥等，其病癥的出現(xiàn)是多種代謝通路異常，機體多功能發(fā)生紊亂的綜合結果[2- 4]。單純的以“血脂”指標作為診斷和研究高脂血癥相關疾病的手段并不全面，容易掩蓋人體內分泌系統(tǒng)異常的真正病因，同時，“血脂”指標只能“宣判”結果而無法實現(xiàn)早期診斷。

氨基酸(amino acids)是構建機體蛋白質分子的基本組成單位，也是調節(jié)營養(yǎng)物質代謝及維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要物質基礎，具有廣泛的生物學功能，氨基酸的含量檢測常常作為機體內分泌平衡及相關器官功能情況的側面反映與輔診依據[5- 10]，還可用于疾病的早期診斷[11- 13]。本研究通過建立食餌性高脂血癥大鼠模型，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)法，對高脂血癥模型大鼠血液中氨基酸譜進行測定，并通過統(tǒng)計學分析對比造模前后大鼠血液中氨基酸譜的變化，尋找高脂血癥代謝特異性氨基酸，為高脂血癥臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SD 大鼠20只，SPF 級，體質量180～220 g，雌雄各半，均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2008- 0002。實驗環(huán)境：廣東省中醫(yī)研究所SPF 級動物實驗室，合格證號SYXK(粵)2010- 0059。所有大鼠均遵循實驗動物倫理學要求進行飼養(yǎng)及實驗操作。

1.2 試藥

高脂飼料(批號D12492)，廣東省醫(yī)學實驗動物中心；膽固醇試劑盒(批號120241)、甘油三酯試劑盒(批號130441)、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號130521)、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號140561)，中生北控生物科技股份有限公司；非諾貝特膠囊(批號20667)，法國利博福尼制藥公司；氨基酸混合對照品(批號BCBT9759，天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)，(批號BCBT8201，濃度100 pmol/μL)，美國Agilent公司；甲醇、甲酸、乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 儀器

ExionLC AC液相色譜儀、X500R QTOF質譜儀，美國Sciex公司；XS205DU型電子分析天平，瑞士Mettler TOLEDO公司；JJ3000型動物電子秤，美國G&G 公司；3K30型低溫冷凍離心機，德國 SIGMA 公司；Varioskan Flash 全波長多功能酶標儀，美國Thermo 公司。

1.4 高脂血癥模型的建立

取SPF級SD大鼠20只，每組10只，雌雄各半，按體質量隨機均分為正常對照組、模型對照組。除正常對照組外，其余大鼠給予高脂飼料，連續(xù)4周。

1.5 生化指標的測定

禁食24 h，于末次給藥1 h后，眼眶后靜脈叢取血，離心(3000 r/min，10 min)分離血清，部分血清于- 80 ℃冰箱中保存，備用。取血清，采用多功能酶標儀測定各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

1.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS法測定

1.6.1 供試品溶液的制備 將血清于室溫下解凍溶解，取20 μL血清樣品于EP管中，加280 μL乙腈，渦旋30 s，靜置10 min，離心(13 000 r/min，10 min)，取上清液，即得。

1.6.2 色譜與質譜條件 色譜柱：Waters XBridge Amide(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：0.2%甲酸甲醇溶液(A)- 0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～3 min，85% A；3～6.5 min，85%～50% A；6.5～9 min，50% A，9～9.1 min，50%～85% A，9.1～15 min，85% A；體積流量0.4 mL/min；柱溫 40 ℃；進樣量 1 μL。Sciex X500R QTOF 質譜儀，電噴霧離子源(ESI)；采用多反應監(jiān)測模式(MRM)進行正離子檢測；霧化氣378.9 kPa，輔助氣 378.9 kPa，氣簾氣 241.1 kPa，霧化溫度 550 ℃，噴霧電壓(ionspray pressure)為5 500 V，優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表1。

表1 優(yōu)化的質譜條件參數(shù)

續(xù)表

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對研究中得到數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。兩組結果比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 生化指標與正常對照組比較

模型組TC(t′=7.437 8，P<0.001)、TG(t′=14.466 3，P<0.01)、LDL-C(t′=5.498 5，P<0.01)均升高，而HDL-C(t′=11.773 2，P<0.01)降低，說明造模成功。見表2。

表2 高脂血癥模型大鼠的生化指標

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS法測定

2.2.1 線性關系、檢測限和定量限 精密吸取氨基酸混合對照品適量，加甲配制成不同濃度的系列混合對照品溶液，按“1.6.2”項下條件進行測定，以峰面積為縱坐標Y，對相應的對照品濃度為橫坐標X，進行線性回歸，得回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍；分別以信噪比(S/N)約為3和10計算檢測限(LOD)及定量限(LOQ)，見表3、圖1。

表3 線性關系、檢測限和定量限考察結果

2.2.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液1 μL，照擬定的條件連續(xù)測定6次，記錄各峰峰面積，結果測得各氨基酸成分峰面積RSD(n=6)均<3%，表明該色譜條件下，儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取制備好的同一供試品溶液1 μL，照擬定的條件，分別在制備樣品后第0、4、8、12、16、20、24 h進樣，記錄各峰峰面積，結果各氨基酸成分峰面積RSD(n=6)均<3%，表明樣品溶液24小時內穩(wěn)定。

圖1 氨基酸成分的MRM提取離子流色譜

表4 高脂血癥模型大鼠血清中氨基酸的變化

2.2.4 重復性試驗 取同一份血清樣品，按“1.6.1”項下方法制備供試品，平行6份，并照擬定的條件測定，記錄各氨基酸成分峰面積并計算其含量，結果各氨基酸成分的平均含量在4.526～28.312 μmol/L，RSD(n=6)均<6%，表明該方法具有良好的重復性。

2.2.5 回收率試驗 取已知含量的同一份血清樣品6份，分別精密加入等量的氨基酸混合對照品，按“1.6.1”項下方法制備供試品溶液，照擬定的條件測定，記錄各峰峰面積并計算含量結果，計算回收率。結果各氨基酸成分的平均回收率分別在96.13%～103.93%，RSD(n=6)均<6%。

2.2.6 樣品測定 取各血清樣品，按“1.6.1”項下方法制備供試品溶液，照擬定的條件測定，記錄各峰峰面積并計算含量結果。結果除Asp、Leu、Ile、Tyr、Arg、His、Glu、Lys在供試品中含量太低，未檢測到，其余8種氨基酸成分均被檢測到。經獨立樣本t檢驗：與正常對照組比較，模型組Met、Phe、Thr、Val五種氨基酸均有降低(t=5.658，2.918，3.486，6.319，P<0.001，0.009，0.003，<0.001)，Pro(t′=4.453，P=0.001)和Gly(t′=2.551，P=0.024<0.01)均有降低，而Ser和Ala均無差異(t=0.789，0.277，P=0.441，0.785>0.05)。結果見表4。

3 討 論

筆者曾對C18反相色譜柱進行考察，發(fā)現(xiàn)氨基酸大多為大極性化合物，在C18柱上保留較弱，而氨基柱對氨基酸的保留較好，故選擇氨基柱；在流動相的考察中，發(fā)現(xiàn)甲醇-水作為流動相時，部分氨基酸的信號較弱，加入甲酸后，增加了氨基酸的電離，信號增強；考察了35 ℃、40 ℃、45 ℃三種不同柱溫對分離效果的影響，結果柱溫40 ℃以上時，信號較穩(wěn)定，故最終選柱溫為40 ℃；考察了0.35 mL/min、0.40 mL/min、0.45 mL/min 三種流速對分離效果的影響，結果流速對分離效果影響不大，綜合分析時間及儀器耐用性，選0.40 mL/min作為分析流速。最終所建立的含量測定方法專屬性高，分離度好。

樣品測試時，部分氨基酸信號較低，無法達到檢出限，可能與取樣濃度較低有關，后續(xù)可加強樣品的濃度，提高低濃度樣品的檢出，使檢測更加準確。

高脂血癥是一種內分泌系統(tǒng)疾病，其病癥的出現(xiàn)是多種代謝通路異常、機體多功能發(fā)生紊亂的綜合結果，其中氨基酸代謝異常，是內分泌失衡及相關器官功能紊亂的重要輔證。本實驗檢測了高脂血癥模型大鼠血液中的14種氨基酸的含量，可以從整體水平上反映高脂血癥建模前后氨基酸代謝變化，通過統(tǒng)計分析，進一步印證了高脂血癥大鼠存在氨基酸代謝的紊亂，其中Met、Phe、Pro、Thr、Val、Gly等6種氨基酸為其潛在的生物標志物，其中蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)是人類、其他哺乳動物和禽類正常生長發(fā)育所必需的氨基酸(有9種必需氨基酸)，而蛋氨酸是體內主要的甲基供體，苯丙氨酸是多種神經遞質的前體，蘇氨酸是一種免疫刺激劑，可促進細胞免疫防御功能，纈氨酸能促進身體正常生長，修復組織，調節(jié)血糖，并提供需要的能量；脯氨酸(Pro)是由谷氨酸合成的非必需氨基酸，是膠原蛋白的重要組成部分，也是潛在的內源性興奮毒素/神經毒素；甘氨酸(Gly)屬于非極性氨基酸，參與人體的DNA，磷脂和膠原蛋白的生產以及能量的釋放。該結果為高脂血癥臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了實驗依據；本研究所建立的氨基酸測定方法穩(wěn)定、可靠，為氨基酸及其結構類似物在復雜體系中的檢測的提供了參考。