IL21納米微球抗原誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答效果的研究

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000)

自2000年人白介素-21(Interleukin-21，IL21)被發(fā)現(xiàn)以來，其生物學(xué)作用越來越受重視。研究發(fā)現(xiàn)：IL21是生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的一類細(xì)胞因子，其生物學(xué)作用非常復(fù)雜，既能夠促進(jìn)機體免疫應(yīng)答，也可抑制機體免疫應(yīng)答，同時對免疫應(yīng)答也能起到調(diào)節(jié)作用；同時，IL21對T、B、NK以及單核巨噬細(xì)胞的激活和調(diào)控也可以起到關(guān)鍵的作用，是人體固有性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞因子。

殼聚糖及甲殼素在濃堿中脫去乙酰基可得到能夠溶于酸性水溶液的聚氨基葡萄糖[1]，是一種天然陽離子性多糖化合物，具有安全、惰性、溶解速度快等優(yōu)點，可作片劑、微丸劑、硬膠囊劑的藥物包衣[2]，具有良好的生物吸收性和相容性，來源豐富、價格低、安全無毒，可以保護(hù)外源基因免遭細(xì)胞內(nèi)溶酶體的破壞，有利于提高外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)[3]。

本研究利用快速膜乳化-熱固化聯(lián)合的方法[4]制備IL21 DNA核酸疫苗，制備粒徑均一可控的殼聚糖季銨鹽凝膠微球，檢測其對脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Balb/c小鼠(山東大學(xué)實驗動物中心提供)，DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清(Gibco)， 脂多糖(Sigma)，CCK-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)，殼聚糖、羥丙基三甲基氯化銨等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2IL21微球的制備 處死小鼠，提取其淋巴細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。根據(jù)IL21序列(Genebank)設(shè)計引物，引物Ⅰ(EcoR I)：5’-TAGCTCTGTCGCCTGGAGACTCAGTTCTG-3’，引物Ⅱ(XhoⅠ)： 5’-CCGGGATATCCTAGGAGAGATGCTGATG-3’。PCR反應(yīng)體系為：94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，40次循環(huán)后72℃延伸10 min。擴增獲得IL21基因片段，用于制備真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-IL21；利用烴丙基三甲基氯化銨對殼聚糖進(jìn)行修飾，制備得到季銨化的殼聚糖；利用快速膜乳化技術(shù)與熱固化法相結(jié)合，制備殼聚糖季銨鹽凝膠微球。

1.3腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 先在小鼠腹腔注射5 ml1640培養(yǎng)液，輕揉腹部后處死小鼠，打開腹腔，抽取腹腔液，離心棄上清液，含小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，培養(yǎng)液充分洗滌，棄去未貼壁細(xì)胞，加入含1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。取巨噬細(xì)胞(5×104個/孔)接種于96孔板，共27孔，分3組(每組9孔)，分別加PBS磷酸鹽緩沖液(空白對照組)、1μg/ml脂多糖(陽性對照組)、20μg/mlIL21微球與1μg/ml脂多糖(共同作用組)。其中上清液用于一氧化氮的測定，細(xì)胞用于活化caspase-3 檢測。

1.4一氧化氮的測定 三組分別取100μl培養(yǎng)上清液與等體積Griess試劑混合，避光，振蕩反應(yīng)10 min后，酶標(biāo)儀測量OD490nm，每組測3孔，計算平均數(shù)。

1.5活化 caspase-3 檢測 各組提取巨噬細(xì)胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Caspase-3：5’-TGACCGAGGCTACATTCAGATGACACC-3’(上游)；5’-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3’(下游)。β-actin：5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3’(上游)：5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’(下游)。反應(yīng)體系為94℃ 10 min，30個循環(huán)(94℃ 50 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min)，72℃ 8 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像系統(tǒng)計算與β-actin光密度值相對表達(dá)量。每組測3孔，計算平均數(shù)。

1.6細(xì)胞增殖率的計算 各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS充分洗滌后，調(diào)整至相同細(xì)胞數(shù)(1×105個細(xì)胞/ml)，三組再培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定吸光度A，每組取3孔平均數(shù)，計算細(xì)胞增殖率=[(A實驗組-A對照組) /A對照組×100%]。

2 結(jié)果

2.1IL21微球的制備情況 制備獲得pcDNA3.1(-)-IL21質(zhì)粒核酸疫苗，經(jīng) EcoR I和XhoⅠ雙酶切電泳鑒定。見圖1。

圖1 IL21微球鑒定電泳圖

2.2IL21微球疫苗對增殖活性的影響 陽性對照組細(xì)胞增值率為(88.86±2.31)%，共同作用組為(49.50±6.34)%。兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.10，P<0.01)。

2.3IL21微球?qū)σ谎趸尫诺挠绊?Griess法檢測表明，空白對照組、陽性對照組、共同作用組一氧化氮的釋放量依次為(8.67±4.26)、(27.67±3.76)、(15.33±2.33)μmol/l。三組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.18，P=0.002)，兩兩比較顯示，陽性對照組高于共同作用組及空白對照組(q=6.03，9.28；P<0.05)，共同作用組與空白對照組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(q=3.25，P>0.05)。

2.4IL21微球?qū)aspase-3的影響 陽性對照組為(1.121±0.058)，共同作用組為(0.717±0.074)，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.44，P=0.002)。

3 討論

IL21為γ鏈家族細(xì)胞子成員之一，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，能促進(jìn)機體由非特異性免疫向特異性免疫的轉(zhuǎn)變[5]。單核-巨噬細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞，能夠在機體免疫防御中發(fā)揮重要作用，具有廣泛的生物學(xué)功能，能觸發(fā)固有免疫應(yīng)答，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，包括嗜菌作用、促炎作用[6-7]。本研究通過PCR技術(shù)，體外擴增得到IL21，制備pcDNA3.1(-)-IL21核酸疫苗，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得出，其目的基因片段為490 nm，與預(yù)計大小一致。利用快速膜乳化-熱固化聯(lián)合的方法制備IL21 DNA核酸疫苗。微球疫苗與小鼠巨噬細(xì)胞分組共同培養(yǎng)后，通過其對與巨噬細(xì)胞免疫效應(yīng)的影響，考察微球疫苗對小鼠免疫應(yīng)答的作用，研究結(jié)論：培養(yǎng)24 h后，與磷酸鹽緩沖液空白對照組相比，脂多糖刺激陽性對照組細(xì)胞的凋亡明顯增加，一氧化氮的釋放和caspase-3的活化明顯增強。

本課題組成功構(gòu)建了殼聚糖季銨鹽凝膠微球疫苗，可有效提高吞噬細(xì)胞殺傷功能，本研究的順利開展為腫瘤疫苗的后續(xù)研究提供了思路和理論依據(jù)。