HDAC2與乙酰化P53k320在胃癌細胞中的表達及對其療效的評價

(臨沂市中心醫(yī)院，山東 沂水 276400)

研究證實，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多個信號通路和多基因共同參與的結果[1]。其中，細胞組蛋白乙?；艿浇M蛋白去乙?；?HDACs)和組蛋白乙?；D移酶的共同調控，當HDACs呈現為病理活性和異常表達后會引發(fā)機體免疫紊亂、肌營養(yǎng)不良以及癌癥的發(fā)生。有研究表明[2]，HDAC2的目標蛋白為抑癌基因P53，其過度表達與惡性腫瘤發(fā)生相關，其表達的高低可作為臨床上獨立的預后指標，也可作為組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)療效的標志。本研究分析HDAC2、乙酰化P53k320在胃癌組織和癌旁組織細胞中的表達，探討其對療效的評價作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月—2019年1月本院收治的胃癌患者130例，其中男86例，女44例；年齡35～75歲，平均(55.5±2.6)歲；腫瘤直徑：>5 cm者29例，≤5 cm者101例；Lauren分型：彌漫型35例，腸型82例，混合型13例；分化程度：高分化67例，中分化34例，低分化29例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期68例，Ⅲ～Ⅳ期62例；淋巴結轉移：有59例，無71例。所有患者或家屬均簽署了知情同意書。所有患者經臨床治療后，完全緩解(CR)65例，部分緩解(PR)26例，穩(wěn)定(SD)19例，進展(PD)20例。

1.2方法

1.2.1組織采集 取所有患者手術切除的癌組織和癌旁組織，其中50%組織在10%中性甲醛中固定，24 h后行常規(guī)石蠟包埋，制作組織切片，厚度為4 μm，用于后續(xù)免疫組化染色。另外50%組織作后續(xù)細胞分離。

1.2.2免疫組化 將所制備的癌組織和癌旁組織石蠟切片在二甲苯中重復脫蠟10 min，行梯度酒精水化，將蛋白酶修復液加入37℃的恒溫冰箱中行孵化處理30 min，去除抗原修復液，將所制備的切片轉移至內含3% H2O2的濕盒中，密封(去過氧化物酶封閉液)，在37℃的恒溫冰箱中行孵化處理10 min，使用PBS清洗。清洗完成后將山羊血清加入，在室溫下封閉處理30 min，將封閉液吸除(濾紙)，加入一抗，放入至適合后加入二抗，在室溫下孵育處理1 h，運用PBS清洗，行DAB顯色10 min，采用梯度乙醇進行脫水，采用二甲苯沖洗片3次直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。每份標本在鏡頭下隨機選擇5個視野，所有病理切片均由2位以上經驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法進行診斷。根據染色程度和染色細胞百分比進行評分：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；著色細胞數≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。陰性(-)得分≤1分，弱陽性(+)得2～3分；中度陽性(++)得4～5分；強陽性(+++)得分≥6分。

1.2.3細胞分離 取備用的癌組織和癌旁組織，去除結締組織后洗凈剪碎，使用0.1%的胰酶、0.025%的Ⅰ型膠原酶在37℃環(huán)境下消化30 min，使用濾網濾渣，在4℃環(huán)境下500×g離心5 min，棄去上清液；在DMEM-E培養(yǎng)基(5 ml，內含20%人血漿)中孵育5 min，細胞重懸后將20%的Percoll細胞分離液在4℃環(huán)境下500×g離心15 min，收集含有細胞的沉淀，經DMEM-E反復洗滌2次，每次均在4℃環(huán)境下500×g離心5 min，將所獲得的細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，使用10% FBS、牛腦抽提物(100 g/ml)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/ml)的DMEM-E培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，棄去上清液，將未貼壁的細胞洗掉后繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)1周后挑選多個形成的集落，混合均勻，轉移至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.4癌細胞中HDAC2 mRNA檢測 采用熒光定量RT-PCR檢測，取對數生長期的胃癌細胞、癌旁細胞按照制備試劑盒說明書提取胎盤組織中總RNA，之后對RNA純度、含量進行檢測，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer5.0軟件對引物序列進行設計，使用RT-PCR方法檢測胃癌細胞中HDAC2 mRNA表達量，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的表達量。HDAC2引物序列：上游：5’-TGACATTGTGCTTGCTGTCC-3’，下游：5’-CCCTCAAGTCTCCTGTTCCA-3’；內參基因GAPDH引物序列：上游：5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

1.2.5癌細胞中HDAC2及乙?；疨53k320蛋白表達的檢測 取對數生長期的胃癌細胞、癌旁細胞，將培養(yǎng)液去除，反復使用PBS沖洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化處理后離心，再次使用PBS反復沖洗2遍，將細胞收集至1.5 mL的離心管中，將200μL預冷的RIPA細胞裂解液在冰上采用超聲儀對細胞進行超聲裂解，2 s/次，共5次，在4℃環(huán)境下500×g離心5 min，將上清液轉移至新離心管中，蛋白定量分裝采用Bradford方法，采用Western blot法檢測胃癌細胞、癌旁細胞中HDAC2蛋白及乙?；疨53k320蛋白表達量。

2 結果

2.1HDAC2及乙?；疨53k320中陽性細胞的表達胃癌組織HDAC2陽性表達率高于癌旁組織，乙?；疨53k320陽性率低于癌旁組織。見表1、封二圖1。

2.2HDAC2 mRNA HDAC2蛋白及乙?；疨53k320蛋白的表達 胃癌細胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白表達量均高于癌旁細胞，乙?；疨53k320蛋白表達量低于癌旁細胞。如表2、封二圖2。

表1 兩種組織HDAC2及乙酰化P53k320中陽性表達情況比較[n(%)]

表2 兩種細胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白及乙?；疨53k320蛋白表達情況

2.3HDAC2及乙酰化P53k320對療效的評價作用 CR、PR、SD、PD組患者癌組織中HDAC2蛋白表達量呈增高趨勢，乙?；疨53k320蛋白表達量呈降低趨勢；兩兩比較顯示，各組之間均有統(tǒng)計學意義(q=5.75～54.76，P<0.05)。見表3、封二圖3。

表3 HDAC2及乙?；疨53k320蛋白表達與療效的關系

3 討論

目前發(fā)現抑癌基因P53與人類腫瘤發(fā)生關系最為密切。臨床推測，胃癌的發(fā)生和進展可能與野生型P53功能受到抑制有關[3]，這種抑制可能與表觀遺傳學組蛋白去乙酰化酶相關[4]。組蛋白乙?；D移酶具有催化乙?；淖饔?，使其轉移至組蛋白乙?；D移酶；而HDACs作用與其相反，可逆轉賴氨酸殘基乙酰化。可逆的乙?；瘯{控非組蛋白，包括P53、NF-κB、STATs等。因此，乙?；囊蕾囃放c其他轉錄后修飾具有一定的相關性，可維持機體動態(tài)平衡。正常P53需部分乙?；?，HDAC2是通過去乙?；{控P53。

k320是位于P53DNA連接域/四聚化結構域，P53信號通路與k320乙?；嚓P。Brandl等[5]研究顯示，結腸癌細胞中HDAC2和P53之間的作用可抑制P53k320乙?；?，進而影響靶基因的轉錄調控。目前，隨著對HDAC2的研究深入，發(fā)現其在多數惡性腫瘤中均呈現高表達，包括卵巢癌、胰腺癌、腎癌、腎癌、肝癌等。Masoud等[6]研究發(fā)現HDAC抑制因子或者RNA抑制劑均會抑制腎癌細胞中HDAC2的高表達。在乳腺癌的研究中表明，抑制HDAC2表達會增強P53靶基因Bax的表達，細胞增殖加速[7-8]。有學者通過分析HDAC2與P53k320乙?；g的相關性[9-10]，認為當P53k320乙酰化降低后會增加P53靶基因的表達，且HDAC2會逆轉P53k320乙?；?，促進細胞增殖。本研究結果顯示，胃癌細胞中HDAC2高表達，乙?；疨53k320低表達，表明在胃癌發(fā)生過程中，HDAC2表達升高可能抑制P53k320乙?；?。此外，本研究結果還顯示，患者治療效果越好者其HDAC2蛋白表達量越低，乙?；疨53k320蛋白表達量越高，這可能與胃癌患者治療后，HDAC2的高表達受抑制，P53k320乙?；黾?，最終促進癌細胞凋亡相關。提示，HDAC2、乙酰化P53k320可作為評估胃癌患者治療效果的指標。