單核苷酸多態(tài)微陣列技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000；2臨沂市婦女兒童醫(yī)院，山東 臨沂 276000)

產(chǎn)前診斷是篩檢先天性缺陷胎兒的主要手段。目前，G帶核型是產(chǎn)前診斷基因異常的主要技術(shù)，但大多數(shù)G顯帶技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，分辨率僅為10 Mb，且存在約10%～40%的失敗率，易受母體的影響[1]。分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)如熒光原位雜交、定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)克服了這些限制，但這些技術(shù)一次只能檢測(cè)幾個(gè)位點(diǎn)。染色體微陣列分析(Chromosomal microarray analysis，CMA)技術(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)高分辨檢測(cè)染色體的微缺失、微重復(fù)綜合征[2]、單親二倍體、雜合性缺失等。本研究對(duì)508例產(chǎn)前診斷的標(biāo)本進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性SNP檢測(cè)和G帶核型分析，意在比較兩種方法的差異，為SNP技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 2016年5月至2018年11月共有508名孕婦在本院產(chǎn)前診斷中心接受產(chǎn)前基因芯片SNP檢測(cè)和核型分析，年齡在19～45歲，孕11～28周。產(chǎn)前診斷的指征主要包括：產(chǎn)前超聲檢查結(jié)果異常，無創(chuàng)或唐篩結(jié)果異常，不良孕產(chǎn)史，夫妻一方染色體異常，孕婦年齡≥35歲等。所有入選的孕婦及其伴侶均接受了檢測(cè)前咨詢，對(duì)基因芯片SNP和常規(guī)核型檢測(cè)知情并簽署同意書。

1.2方法

1.2.1染色體核型分析 在508例樣本中，采集羊水482例、絨毛24例、臍血2例，絨毛膜絨毛、羊水各需采集30 ml，臍帶血采集2 ml。將抽取的羊水、絨毛、臍血在無菌條件下按常規(guī)操作進(jìn)行培養(yǎng)、收獲、制片和CTG-胰酶顯帶，染色體長(zhǎng)度320分帶水平，按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2012)標(biāo)準(zhǔn)分析計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，如疑為嵌合型則計(jì)數(shù)不少于50個(gè)分裂相。

1.2.2SNP檢測(cè)分析 經(jīng)過DNA提取、片段化、擴(kuò)增、純化、定量、標(biāo)記后雜交掃描，應(yīng)用Affymetrix CytoScan 750K Array檢測(cè)全基因組染色體。將檢測(cè)到的拷貝數(shù)增減與公共CNV數(shù)據(jù)庫(kù)(DGV、OMIM、GENES、UCSC、DECIPHER等)中的拷貝數(shù)增減進(jìn)行比較，結(jié)果分為明確致病CNV，意義不明確CNV和多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1產(chǎn)前診斷指征的分布 此次共收集標(biāo)本508例，SNP檢測(cè)檢出異常110例，失敗2例，陽性檢出率為21.65%；染色體核型分析出異常67例，失敗1例，陽性檢出率為13.19%。二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.65，P<0.01)。兩組失敗者均列為正常。SNP檢測(cè)出的110例中，包含47例非整倍體，27例致病性CNV，36例不明確性CNV；47例非整倍體中，包括21三體8例，13三體2例，18三體6例，45,X 4例，47,XXX 10例、47,XXY 12例、47,XYY 4例、2號(hào)三體33%嵌合1例；27例致病CNV情況詳見表2-4。染色體核型檢測(cè)出異常67例，其中包括46例非整倍體(2號(hào)三體嵌合1例核型檢測(cè)失敗)，14例不平衡易位(>10 Mb)，5例平衡易位，2例47,XN,+mar。詳見表1。

表1 產(chǎn)前診斷指征分類、SNP檢測(cè)及染色體核型分析結(jié)果(n)

注：*為21三體

2.2兩種檢測(cè)結(jié)果的比較 SNP檢測(cè)和核型分析均可以檢測(cè)出所有的非整倍體和>10Mb的不平衡易位，14例不平衡易位的檢測(cè)情況見表2；染色體核型分析檢出2例47,XN,+mar，SNP可追溯微小額外標(biāo)記染色體的來源和性質(zhì)，見表3；染色體核型分析檢出5例平衡易位，SNP均未檢出。在染色體核型分析正常的病例中，SNP共檢測(cè)出12例明確致病CNVs，其變異片段大小范圍211 kb～11.6 Mb，涉及1q21.1微缺失綜合征、22q11.2微重復(fù)綜合征、Prader-Willi綜合征/Angelman綜合征、16p13.11微缺失綜合征、16p13.11微重復(fù)綜合征、Netherton syndrome(瑟頓綜合征)，見表4。

表2 14例不平衡易位的SNP檢測(cè)和核型分析結(jié)果比較

表3 2例未知額外小標(biāo)記染色體的SNP檢測(cè)和核型分析結(jié)果比較

表4 12例胎兒染色體核型分析正常但SNP結(jié)果異常病例

3 討論

染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的主要依據(jù)，但存在較多的缺點(diǎn)。近年來，單核苷酸多態(tài)性SNP檢測(cè)在此領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并顯示出較大的優(yōu)越性。本研究對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明，在本組病例中，SNP陽性檢出率高于染色體核型分析；SNP對(duì)不平衡易位和額外小標(biāo)記染色體有優(yōu)勢(shì)，可以對(duì)斷裂的位置給出更精準(zhǔn)的定位，提高額外小標(biāo)記染色體的診斷準(zhǔn)確性。在染色體核型分析正常的病例中，SNP共檢測(cè)出12例明確致病CNVs，所檢出的CNVs變異片段大小范圍在211 Kb～11.6 Mb之間，含有GJA5、TBX1、UBE3A、MYH11等致病基因，涉及1q21.1微缺失綜合征、22q11.2微重復(fù)綜合征、Prader-Willi[3]綜合征/Angelman綜合征、16p13.11微缺失綜合征[4]、16p13.11微重復(fù)綜合征、Netherton syndrome(瑟頓綜合征)；病例3中核型檢測(cè)結(jié)果為46,XN，dup(11)(q23.3q25)，SNP檢測(cè)到樣本不僅在11號(hào)染色體q23.3q25區(qū)域存在18.2 Mb重復(fù)，而且在22號(hào)染色體q11.1q11.21區(qū)域存在3.4 Mb重復(fù)，該兩段變異片段可導(dǎo)致Emanuel syndrome；病例12中核型分析認(rèn)為12號(hào)染色體短臂異常，無法確定其具體來源，但SNP檢測(cè)到樣本18號(hào)染色體q22.1q23區(qū)段存在13.9 Mb片段的重復(fù)，12號(hào)染色體12p13.33區(qū)段存1.2 Mb片段的缺失，故根據(jù)SNP結(jié)果，最終確定核型結(jié)果為46,XN，der(12)t(12;18)(p13;q22)；SNP鑒定了2例sSMC胎兒中的1例(病例15)，結(jié)果顯示11號(hào)染色體11q23.3q25區(qū)段存在18.25 Mb片段的重復(fù)，故可判斷胎兒sSMC來源于11q23.3q25區(qū)段，內(nèi)含APOA4，APOC3，APOA1，SIK3，PAFAH1B2等128個(gè)OMIM基因。但對(duì)于平衡易位、倒位、插入、<1Kb的缺失重復(fù)、<30%的低比例嵌合、點(diǎn)突變等基因芯片不能檢測(cè)[5]；此外，本次研究SNP共檢測(cè)出36例意義不明確CNVs(vous)，檢出率7.09%，文獻(xiàn)報(bào)道，基因芯片技術(shù)在進(jìn)行全基因組掃描時(shí)，會(huì)出現(xiàn)12%～15%的臨床意義不明的vous[6]，對(duì)于vous的胎兒一般建議進(jìn)行親代驗(yàn)證，以確定CNV為新生還是遺傳，筆者對(duì)此36例患者進(jìn)行了隨訪，成功隨訪23例，其中16例出生后生長(zhǎng)發(fā)育良好，4例選擇了終止妊娠，1例出生后右手六指(其他發(fā)育正常)，2例在孕后期停止發(fā)育，其中1例在15號(hào)染色體q26.3區(qū)域存在501 kb的重復(fù)，對(duì)其父母進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)其重復(fù)來源于母親，考慮胎兒攜帶的該區(qū)域的重復(fù)可能為良性，其致死的原因可能由于其他疾病引起，另1例13號(hào)染色體q21.1q22.2區(qū)段存在16.6 Mb的片段缺失，由于缺失片段較大，考慮為引起胎兒死亡的原因，該區(qū)域的缺失偏致病性，這為以后充實(shí)本地的數(shù)據(jù)庫(kù)提供了依據(jù)。

綜上所述，產(chǎn)前基因芯片SNP技術(shù)是篩查染色體缺失和重復(fù)的一種有價(jià)值的工具，特別是在核型正常報(bào)告的胎兒中。隨著技術(shù)的不斷提高和數(shù)據(jù)的不斷積累，SNP技術(shù)將在產(chǎn)前診斷上發(fā)揮重要的作用。