氣相色譜法對藥物中間體5－氯－2－異丙基－4－戊烯酸苯乙胺鹽的質(zhì)量分析

張從芬，許 亮，周玉琢

（1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241002；2.江蘇中丹制藥有限公司，江蘇 泰州 225453）

5－氯－2－異丙基－4－戊烯酸苯乙胺鹽實(shí)際上是拮抗劑藥物中間體，主要用于心血管病的治療。藥物中間體是一些用于藥品合成工藝過程中的一些化工原料或化工產(chǎn)品。這種化工產(chǎn)品，不需要藥品的生產(chǎn)許可證，在普通的化工廠即可生產(chǎn)，只要達(dá)到某些級別，即可用于藥品的合成。

在生命的產(chǎn)生和進(jìn)化過程中，造成了生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、酶和細(xì)胞表面受體具有特定的手性結(jié)構(gòu)，因此生物體對不同立體手性分子具有不同的生理和化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致光學(xué)活性不同的手性分子具有不同的藥理和毒理作用［1，2］。大多數(shù)手性藥物中不同的光學(xué)異構(gòu)體具有不同的藥理和毒理作用。歐洲、日本和美國的藥政部門相繼作出了相應(yīng)的管理規(guī)定：手性藥物以單一對映體上市。自此之后，手性藥物的市場一直保持快速增長的態(tài)勢，手性藥物的研發(fā)已成為當(dāng)今世界新藥研發(fā)的發(fā)展方向和熱點(diǎn)領(lǐng)域。從而也帶動了手性中間體的發(fā)展。研究表明5－氯－2－異丙基－4－戊烯酸苯乙胺鹽的左旋體是具有藥物療效的，所以在對其質(zhì)量研究過程中，把手性的拆分放在重中之重的位置［3，4］。

5－氯－2－異丙基－4－戊烯酸苯乙胺鹽的結(jié)構(gòu)式：

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

氣相色譜儀：島津2010及GCsolution工作站。

1.2 試劑

二氯甲烷，甲醇，氯化亞砜（分析純），三重蒸餾水。

化學(xué)反應(yīng)過程：

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品處理

稱取0.5～1.0g樣品用5mL二氯甲烷溶解，加入5mL水和1～2mL 35%鹽酸。攪拌后檢測上層水層的pH值在0～1。用分液漏斗分出下層有機(jī)層，加入5mL水和1mL 35%鹽酸，進(jìn)行兩次酸化，攪拌后分層，將下層有機(jī)層分至100mL燒瓶中于60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮。向燒瓶中加入5mL二氯甲烷后，加入1滴吡啶，緩慢加入氯化亞砜2g，在40℃條件下攪拌40min。降溫后，緩慢加入10g甲醇，攪拌5min后于60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮，直到?jīng)]有液體蒸出為止。用10mL二氯甲烷稀釋，加10mL水進(jìn)行水洗分層。取下層有機(jī)層真空除去溶劑。最后，用10mL二氯甲烷稀釋，用硫酸鎂干燥，用0.45μm濾膜過濾后，取濾液，測定異構(gòu)體。取2滴濾液，加入1mL二氯甲烷稀釋后進(jìn)樣，測定手性。

色譜圖中9.1min處出現(xiàn)的雜質(zhì)峰可能是樣品中的苯乙胺，在配樣過程中的一次酸化和兩次酸洗正是去除苯乙胺，加大鹽酸的量可以更好地去除苯乙胺，原以為加大鹽酸的量會導(dǎo)致8.7min處的酸峰變大（規(guī)定酸峰應(yīng)控制在1%以下），結(jié)果發(fā)現(xiàn)將鹽酸的量控制在25mL以內(nèi)是不會產(chǎn)生影響的。為證明此推論，取SintoB03－A070334樣，配成2份樣品，1份加25mL鹽酸配，1份加30mL鹽酸配，其他步驟正常。結(jié)果如圖1、圖2。

圖1 加30mL鹽酸的GC圖譜

圖2 加25mL鹽酸的GC圖譜

2.2 系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)

取溶劑二氯甲烷0.2μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。SintoB03－A070334樣品0.8g，按“2.1”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖。另進(jìn)一空針，記錄色譜圖（見圖3、圖4）。

圖3 二氯甲烷的GC圖譜

圖4 樣品的GC圖譜

從色譜圖中可以看出，二氯甲烷約在1.25min左右出峰；SintoB約7.2min左右出峰。2.5min之前是溶劑峰，而10min以后系統(tǒng)中出現(xiàn)了一個小的雜質(zhì)峰，這并不影響我們對樣品的分析，可以忽略。從色譜圖中可以看出樣品中各組分的分離度均大于1.5［5］。

2.2.1 線性實(shí)驗(yàn)

取供試品約0.8g，按“2.1”項(xiàng)下操作，以二氯甲烷分別稀釋至濃度為50.0、60.0、70.0、80.0、90.0mg／mL的溶液，各取0.2μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝243482X－17809，r＝0.9997?？梢?SintoB 在 50.0～90.0mg／mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

配制濃度約為80mg／mL SintonB樣品溶液，進(jìn)樣0.2μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD為0.16%。如表1。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取SintoB03－A070334批樣品，按“2.1”項(xiàng)下操作平行測定6次，計(jì)算其含量分別為99.82%、99.79%、99.83%、99.90%、99.70%、99.83%，平均值為99.81%，RSD為0.07%。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下方法，取供試品溶液1份，于室溫下放置，每隔1h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6h，進(jìn)樣量為0.2μL，記錄峰面積，RSD＝0.66%，說明樣品溶液在6h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.5 最低檢測限

在選定的色譜條件下，按信噪比為3對最低檢測限進(jìn)行測定，結(jié)果表明，最小檢出量0.05μg／mL。

2.3 其他異構(gòu)體測定

2.3.1 色譜條件：

儀器名稱：GC－2010；柱型：DB－624；柱參數(shù)：柱長30m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚1.8μm；溫度范圍：0℃～260℃；監(jiān)測器類型：FID；檢測溫度（℃）：300℃；進(jìn)樣溫度（℃）：250℃；柱溫（℃）：初始溫度100℃，保持1min，以15℃／min的速率升溫至260℃，保持15min；保留時間：26.67min；分流比：10；檢測參數(shù)：柱頭壓137.9kPa；柱流速4.0mL／min；清洗流速3.0mL／min；補(bǔ)償氣流速30mL／min；氫氣流速40mL／min；空氣流速400mL／min。

2.4 外消旋體拆分

2.4.1 色譜條件

儀器名稱：GC－2010；柱型：Lipodex－E，柱參數(shù)：柱長50m，內(nèi)徑0.25mm，溫度范圍0℃～200℃；檢測器類型：FID；檢測溫度：220℃；進(jìn)樣溫度：260℃；柱溫：90℃恒溫；保留時間：70min；分流比：10；檢測參數(shù)：柱頭壓131.0kPa，柱流速0.91mL／min，清洗流速 3.0mL／min，補(bǔ)償氣流速30mL／min，氫氣流速40mL／min，空氣流速400mL／min。

2.4.2 外消旋體拆分

取SintoB03樣品約0.8g，按“2.1”項(xiàng)下操作，作為供試品溶液。取1mL二氯甲烷，作為對照品溶液。精密吸取對照溶液和供試品溶液各0.2μL，注入氣相色譜儀，測定，按面積歸一法以峰面積計(jì)算，即得。3批樣品的手性含量分別為98.56%、98.45%、98.35%。

表1 精密度數(shù)據(jù)

圖5 SintoB03手性測定GC圖譜

3 討論

3.1 樣品的配制

樣品配樣過程中一次酸化和兩次酸洗是去除原料苯乙胺，加氯化亞砜（加熱）起氯化作用，吡啶是催化劑。加甲醇是為了酯化，加無水硫酸鎂是除水。

配樣過程的一些注意點(diǎn)：SintonB01，11配樣首先要調(diào)好pH，加甲苯萃取后要吸甲苯層，不要吸到下層，否則進(jìn)樣時甲醇峰會比較大或者雜質(zhì)多，主含量會降低。進(jìn)完樣后，要先用水洗針，再用無水乙醇洗，最后用二氯甲烷洗以防堵針。SintonB02，03配樣過程中加甲醇的量不可以過多，否則很難旋干，做手性時會出現(xiàn)甲醇峰，太少則酯化不完全，測得樣品含量偏低；加熱時間不可以過短，過短則氯化可能不完全，導(dǎo)致加甲醇時酯化不完全，含量偏低，時間如果過長會出現(xiàn)鬼峰。進(jìn)樣時要快要穩(wěn)，否則有可能峰分叉。進(jìn)完SintonB01，11樣后，最好進(jìn)一針二氯甲烷，以防酸峰高。

色譜圖中有時會出現(xiàn)的鬼峰，排除系統(tǒng)原因，有可能是我們在配樣過程中幾次取代反應(yīng)的副反應(yīng)所產(chǎn)生的雜質(zhì)，如加熱過程的氯代反應(yīng)，加甲醇過程的酯化反應(yīng)。所以在配樣過程中加大溶劑二氯甲烷的量，使整個反應(yīng)過程在樣品濃度較稀的情況下進(jìn)行，降低了加熱時的溫度，減少了反應(yīng)時間，這樣可以減少副反應(yīng)。研究中發(fā)現(xiàn)溫度控制在30℃～35℃，時間控制在35min左右，效果比較好。

GC色譜圖中約8.9min時出現(xiàn)的雜質(zhì)峰是我們配制樣品好壞的一個重要的參照點(diǎn)，一般要求這個峰控制在0.5%以下。開始時，我們是嚴(yán)格按照公司的分析規(guī)程上規(guī)定的進(jìn)行培樣，結(jié)果并不十分理想。我們嘗試改動一下培樣的過程：稱取0.7～0.8g樣品用20mL二氯甲烷溶解，加入20mL水和15～20mL 35%鹽酸。攪拌后檢測上層水層的pH值在0～1。用分液漏斗分出下層有機(jī)層，加入15mL水和10mL 35%鹽酸，進(jìn)行一次酸化，攪拌后分層，將下層有機(jī)層分至100mL燒瓶中于60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮。向燒瓶中加入20mL二氯甲烷后，加入1滴吡啶，緩慢加入氯化亞砜2g，在35℃條件下攪拌35min。降溫后，緩慢加入10g甲醇，攪拌20min后于60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮，直到?jīng)]有液體蒸出為止。用10mL二氯甲烷稀釋，加10mL水進(jìn)行水洗分層。取下層有機(jī)層真空除去溶劑。最后，用10mL二氯甲烷稀釋，用一匙無水硫酸鎂干燥，用0.45μm濾膜過濾后，取濾液。結(jié)果單個雜質(zhì)峰趨于0.2%穩(wěn)定。

3.2 氫氣和空氣的比例對FID（氫焰）檢測器的影響

氫氣和空氣的比例依檢測設(shè)備而定，一般應(yīng)在1∶10至3∶10之間，當(dāng)氫氣比例過大時FID檢測器的靈敏度急劇下降，其它條件不變的情況下，靈敏度下降時要檢查一下氫氣和空氣的流速。氫氣和空氣不足時點(diǎn)火會發(fā)出“砰”的響聲，隨后火就滅了。判斷FID檢測器是否點(diǎn)著火，不同的儀器判斷方法不同，有基流顯示的要看基流大小，沒有基流顯示的用帶拋光面的扳手湊近檢測器出口，觀察其表面有無水汽凝結(jié)。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)氫氣和空氣的比例為1∶10時，分離度最好，基線也相對穩(wěn)定。

［1］曾蘇.手性藥物與藥品安全［J］.今日藥學(xué)，2009，19（10）：3.

［2］胡文浩，周靜.手性，手性藥物及手性合成［J］.化學(xué)教學(xué)，2009（5）：1－3.

［3］劉慶彬.酶催化工藝用于制藥工業(yè)的研究進(jìn)［J］.化工進(jìn)展，2004（6）：590－594.

［4］楊光華.病理學(xué)［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：57－79.

［5］國家藥典委員會.中國藥典（二部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：124－126.