PLCγ1 在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用

郝肖瓊,賈方毅,付旭陽(yáng)

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100094)

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞從胚胎時(shí)期起就被阻滯在減數(shù)分裂I 前期的雙線期,卵泡壁層顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的C 型鈉肽(NPPC)結(jié)合其鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶受體2(NPR2),產(chǎn)生的cGMP 是維持減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵因子[1],青春期來(lái)臨后,下丘腦產(chǎn)生促黃體激素(LH)峰,通過(guò)促進(jìn)顆粒細(xì)胞中EGF 樣生長(zhǎng)因子的表達(dá)[2],轉(zhuǎn)激活卵丘細(xì)胞中的EGF 受體(EGFR),從而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂[3]。

前期的研究表明,LH-EGFR 信號(hào)升高卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,高水平的鈣離子降低NPR2 與NPPC 的親和性,使NPR2 失活,cGMP 水平下降,最終導(dǎo)致減數(shù)分裂的恢復(fù)[4],因此,卵丘細(xì)胞內(nèi)高濃度的鈣離子是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的關(guān)鍵所在,但卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平究竟是怎樣升高的,目前還不清楚。

激活磷脂酶C(PLC)啟動(dòng)磷脂酰肌醇信號(hào)通路,產(chǎn)生的1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)能夠升高胞內(nèi)鈣離子水平。 PLC 家族具有多種同工酶,目前已發(fā)現(xiàn) 六 大 類(lèi)： PLCβ、 PLCγ、 PLCδ、 PLCε、 PLCζ 和PLCη,共13 種亞型[5]。 PLC 廣泛分布于機(jī)體的各組織中,對(duì)機(jī)體多種生理活動(dòng)做出了重要的調(diào)控。其中,生長(zhǎng)因子受體可引起PLCγ1 的活化[6],產(chǎn)生IP3導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子釋放,另外,PLCγ1 還參與細(xì)胞增殖、分化、受體內(nèi)吞、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等活動(dòng)[7-8]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3R 鈣庫(kù)釋放升高了胞內(nèi)鈣離子水平[9-10],這一過(guò)程可通過(guò)激活PLCγ1 產(chǎn)生IP3實(shí)現(xiàn)。IP3R 基因家族編碼三種同源IP3結(jié)合蛋白,形成三種亞型[11]：IP3R1、IP3R2 以及IP3R3,受體在不同組織中存在不同的表達(dá)多樣性,在卵巢中的表達(dá)情況目前尚未有報(bào)道。

本文主要探究了LH-EGFR 信號(hào)通過(guò)PLCγ1 促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù),以及下游分子IP3R1的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用21～23 d(12～14 g) SPF 級(jí)C57BL/6J 雌性小鼠(200 只)購(gòu)于中科院遺傳所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK (京) 2015-0019],本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(包院字20180901),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[SYXK (京) 2015-0028]：22℃～24℃恒溫,12 h/12 h 光照/黑暗交替,自由采食飲水,按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

孕馬血清(PMSG, 浙江寧波激素廠);NPPC、EGF、milrinone、U73122、牛血清白蛋白(Sigma 公司,美國(guó));LH(Sigma 公司,美國(guó));Fluo 3-AM(日本同仁化學(xué)研究所);MEMα 粉末狀培養(yǎng)基(Gibco 公司,美國(guó));RNA 提取試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen 公司,美國(guó));TransStart Green qPCR SuperMix(全式金公司);cGMP 檢測(cè)試劑盒(Cayman 公司,美國(guó));免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);蛋白質(zhì)濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液、5×SDS 上樣緩沖液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);TEMED(Amresco 公司,美國(guó));高靈敏度化學(xué)發(fā)光顯色液、PVDF 膜(Millipore 公司,美國(guó));IP3R1 抗體由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所唐鐵山研究員惠贈(zèng)。

體視顯微鏡、石蠟切片機(jī)(Lecia 公司,德國(guó));A1激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon 公司,日本);Realtime PCR 儀(Appiled Biosystems 公司,美國(guó));電泳儀、電泳槽(Bio-Rad 公司,美國(guó));化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù)有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)膜(Millipore 公司,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)的分離及培養(yǎng)

小鼠腹腔注射PMSG 5 IU/只,44 ～46 h 后處死取卵巢,卵巢放置在預(yù)先平衡好的MEMα 液(含1 μmol/L milrinone 抑制卵母細(xì)胞成熟)中,用1 mL 注射器刺破卵泡,撿取形態(tài)良好、卵丘細(xì)胞包裹均勻的COCs,COCs 培養(yǎng)于含有30 nmol/L NPPC 的MEMα 液中,添加10 ng/mL EGF 以及40 μmol/L U73122;進(jìn)行U73122 的劑量依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)研究時(shí),培養(yǎng)液中含有30 nmol/L NPPC、10 ng/mL EGF 以及不同劑量的U73122,此外,U73122(40 μmol/L)對(duì)減數(shù)分裂自發(fā)恢復(fù)的影響也做了研究。 COCs 于37℃,5% CO2,95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng),4 h 后,脫去卵丘細(xì)胞,觀察卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD 的比率。 每次實(shí)驗(yàn)每組使用30 枚COCs。

1.3.2 卵泡的分離及培養(yǎng)

卵巢取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠,用1 mL注射器分離卵泡(直徑300 ～400 μm),將分離好的卵泡放置在0.44 μm 孔徑的細(xì)胞培養(yǎng)膜上,培養(yǎng)膜懸浮放置在35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中(添加1.5 mL MEMα 液),MEMα 液添加或者不添加1 μg/mL LH以及40 μM U73122;于37℃,5% CO2,95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng),4 h 后,刺破卵泡,脫去卵丘細(xì)胞,觀察卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD 的比率。 每次實(shí)驗(yàn)每組使用20 枚卵泡。

1.3.3 卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的檢測(cè)

COCs 取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵巢,培養(yǎng)于MEMα 液中,MEMα 液含有30 nmol/L NPPC,添加10 ng/mL EGF 以及40 μmol/L U73122,于37℃,5% CO2,95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h,之后PBS 清洗3 次,加入5 μmol/L 鈣離子熒光探針Fluo 3-AM 孵育20 min,之后PBS 清洗3 次,在A1 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,綠色熒光表示胞內(nèi)鈣離子水平,熒光強(qiáng)度代表胞內(nèi)鈣離子水平相對(duì)值。 每次實(shí)驗(yàn)每組使用15 枚COCs。

1.3.4 Real-time PCR

細(xì)胞樣品取自注射PMSG 44 ～46 h 的小鼠卵巢,PBS 清洗,總RNA 的提取依照RNeasy micro-RNA isolation kit 操作指南進(jìn)行,總RNA 的反轉(zhuǎn)依照QuantiTek 反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行,得到cDNA。 在ABI 7500 Real-time PCR 系統(tǒng)下進(jìn)行反應(yīng),每個(gè)樣品重復(fù)3 次,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 實(shí)驗(yàn)所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 Realtime-PCR 引物序列Table 1 Gene primer sequences

1.3.5 Western blot

顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與裸卵均取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵巢,加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解,BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,之后加入1×SDS 上樣緩沖液,沸水煮10 min;將處理好的樣品加入凝膠中,進(jìn)行凝膠電泳(5%濃縮膠,60 V,40 min,10%分離膠,100 V,1.5 h),之后采用濕法轉(zhuǎn)膜(100 V,1 h);含有5%奶粉的TBST 封閉2 h,一抗孵育4℃過(guò)夜;二抗孵育1 h,使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

1.3.6 免疫組織化學(xué)

小鼠腹腔注射PMSG 44 ～46 h 后取卵巢,置于4%多聚甲醛中固定48 h,酒精脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(組織厚度5 μm),用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)：微波爐高火4 min,低火3×4 min,然后按免疫組化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行染色、DAB 顯色、蘇木精復(fù)染,封片觀察。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)cGMP 水平檢測(cè)

COCs 取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵巢,放置于MEMα 培養(yǎng)液中(每組需100 枚COCs)培養(yǎng)2 h,MEMα 液含有30 nmol/L NPPC,添加10 ng/mL EGF 以及40 μmol/L U73122,PBS 清洗后收集各組COCs,cGMP 含量依據(jù)cGMP 酶聯(lián)免疫試劑盒中提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3 次,并使用來(lái)自不同小鼠的樣本進(jìn)行。 用Sigma plot 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)類(lèi)型采用方差分析(ANOVA)和t 檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(± s)表示,P＜0.05 為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PLC 不同亞型mRNA 在顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況

激活PLC 啟動(dòng)磷脂酰肌醇信號(hào)通路,使胞內(nèi)鈣離子水平升高,PLC 有多種亞型,我們檢測(cè)了不同亞型在顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞中的表達(dá)情況。 結(jié)果表明,小鼠注射PMSG 44～46 h 后,卵泡壁層顆粒細(xì)胞中Plcγ1 mRNA 的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它亞型(P＜0.05) (圖1A),這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在卵丘細(xì)胞中,卵丘細(xì)胞中Plcγ1 mRNA 的表達(dá)水平顯著高于其它亞型(P ＜0.05) (圖1B),這些結(jié)果提示PLCγ1 在減數(shù)分裂恢復(fù)中可能發(fā)揮主要作用。

圖1 PLC 不同亞型mRNA 在顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞中的表達(dá)情況Figure 1 The mRNA expression levels of PLC isoforms in granulosa cells and cumulus cells

2.2 PLCγ1 抑制劑U73122 抑制EGF 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)

注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞中Plcγ1 mRNA 的表達(dá)水平最高,因此PLCγ1 可能主要參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的過(guò)程。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)添加PLCγ1 特異的抑制劑U73122 可顯著抑制EGF 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)(P ＜0.05) (圖2A),卵母細(xì)胞成熟率僅為(47.87±2.16)%,遠(yuǎn)低于對(duì)照組(90.53±0.86)%,且U73122 的抑制效果呈劑量依賴(lài)性(圖2B),這些結(jié)果表明PLCγ1 在EGF 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。

2.3 PLCγ1 抑制劑U73122 抑制EGF 誘導(dǎo)的卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高

圖2 PLCγ1 抑制劑U73122 對(duì)EGF 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的影響Figure 2 The effect of U73122 on EGF-induced meiotic resumption

卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的升高是EGF 促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)的關(guān)鍵[4,12],本研究提示PLCγ1 參與了EGF 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù),EGF 可能通過(guò)PLCγ1 啟動(dòng)磷脂酰肌醇信號(hào)通路,使卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高。 因此,同時(shí)檢測(cè)抑制PLCγ1 對(duì)卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響。 與之前的研究結(jié)果相同[4],對(duì)照組卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(綠色熒光)十分微弱(圖3A),添加EGF 后顯著增加了胞內(nèi)鈣離子熒光水平(圖3A),然而,PLCγ1 的抑制劑U73122 可明顯逆轉(zhuǎn)EGF 介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子水平增加(P ＜0.05) (圖3A),熒光強(qiáng)度同樣也顯著下降(P ＜0.05) (圖3B),這表明EGF 確實(shí)通過(guò)PLCγ1升高了卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,抑制PLCγ1 的作用則導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子水平無(wú)法升高。

2.4 PLCγ1 抑制劑U73122 逆轉(zhuǎn)EGF 介導(dǎo)的胞內(nèi)cGMP 水平下降

卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高可使NPR2 失活,cGMP 水平下降,導(dǎo)致減數(shù)分裂恢復(fù)[4]。 cGMP 水平的變化代表了NPR2 鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶活性的變化,本研究檢測(cè)了U73122 對(duì)COCs 內(nèi)cGMP 水平的影響。結(jié)果表明,對(duì)照組添加NPPC 處理細(xì)胞,胞內(nèi)cGMP水平上升,而EGF 顯著降低了胞內(nèi)cGMP 水平(圖4),與之前的報(bào)道一致[1],添加U73122 顯著逆轉(zhuǎn)EGF 介導(dǎo)的胞內(nèi)cGMP 水平下降(P ＜0.05) (圖4),這說(shuō)明EGF 通過(guò)PLCγ1 升高了細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,高水平的鈣離子可降低NPR2 活性,導(dǎo)致cGMP 水平下降。

圖3 PLCγ1 抑制劑U73122 對(duì)卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響Figure 3 Effect of U73122 on EGF-mediated calcium elevation

圖4 U73122 對(duì)COCs 內(nèi)cGMP 水平的影響Figure 4 Effects of U73122 on cGMP levels in COCs

2.5 PLCγ1 抑制劑U73122 抑制LH 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)

根據(jù)上述研究結(jié)果,本研究進(jìn)一步采用卵泡培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)狀態(tài),研究U73122 對(duì)LH 誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)的作用。 結(jié)果顯示,添加LH 誘導(dǎo)了減數(shù)分裂的恢復(fù),而U73122 明顯抑制LH 誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)(P ＜0.05) (圖5),卵母細(xì)胞的成熟率僅為(46.98±1.43)%,LH 是通過(guò)激活卵丘細(xì)胞內(nèi)的EGF 受體發(fā)揮作用的[3],因此,這些結(jié)果說(shuō)明LH/EGFR 信號(hào)通過(guò)PLCγ1 升高卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,使NPR2 失活,cGMP 水平下降,最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。

2.6 IP3R 不同亞型mRNA 在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況

PLCγ1 的下游分子IP3R,IP3R 具有三種亞型IP3R1、IP3R2 以及IP3R3,其相應(yīng)基因?yàn)镮tpr1、Itpr2以及Itpr3。 本研究發(fā)現(xiàn),注射了PMSG 44 ～46 h 的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中,Itpr1 mRNA 的表達(dá)水平均顯著高于其它兩種亞型(P ＜0.05) (圖6A、6B 和6C),提示三種亞型中IP3R1發(fā)揮主要作用。

2.7 IP3R1 在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中的表達(dá)定位

Western blot 結(jié)果表明,IP3R1 在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中都有表達(dá)(圖7A),免疫組織化學(xué)的結(jié)果同樣顯示IP3R1 在三種細(xì)胞中均有表達(dá)(圖7B),這說(shuō)明IP3R1 在PLCγ1 升高胞內(nèi)鈣離子水平的過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖5 U73122 對(duì)LH 誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中的影響Figure 5 The effect of U73122 on LH-induced meiotic resumption

圖6 IP3R 不同亞型mRNA 在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況Figure 6 The mRNA expression levels of IP3R isoforms in granulosa cells, cumulus cells and oocytes

圖7 IP3R1 在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況Figure 7 The expression of IP3R1 protein in granulosa cells, cumulus cells and oocytes

3 討論

卵泡壁層顆粒細(xì)胞表達(dá)的NPPC,可與卵丘細(xì)胞中的受體NPR2 結(jié)合,產(chǎn)生的cGMP 是維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵因子[1],前期研究表明,LH-EGFR 信號(hào)升高了卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,使NPR2 與NPPC 的親和性下降,導(dǎo)致NPR2 失活,cGMP 水平下降,最終誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)[4]。 卵丘細(xì)胞內(nèi)高水平的鈣離子決定著減數(shù)分裂恢復(fù)的進(jìn)程,而胞內(nèi)高濃度的鈣離子是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)動(dòng)員導(dǎo)致的[4]。 本研究發(fā)現(xiàn),LH/EGFR 信號(hào)通過(guò)PLCγ1 與IP3R1 升高了卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,導(dǎo)致NPR2 失活與減數(shù)分裂恢復(fù)。

內(nèi)源性的PLC 是調(diào)控多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子,PLC 具有多種亞型,其中,Plcγ1 mRNA 的表達(dá)水平在顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞中是多種亞型中最高的,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它亞型,PLCγ1 特異的抑制劑U73122 能夠顯著抑制EGF 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù),新霉素(PLC 抑制劑)可抑制體外培養(yǎng)的牛和豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)[13],這些結(jié)果說(shuō)明PLC 可能在這一過(guò)程中發(fā)揮作用。 本研究進(jìn)一步證明是PLCγ1 參與了減數(shù)分裂恢復(fù)的進(jìn)程。 EGFR信號(hào)與PLCγ 的活化相耦聯(lián)[14-15],而本研究表明EGFR 信號(hào)通過(guò)PLCγ1 誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù),也間接證明了這一點(diǎn)。

前期的研究表明,EGF 誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的核心是升高了卵丘細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平,使NPR2 失活[4,12],而激活PLCγ1 即產(chǎn)生IP3,升高胞內(nèi)鈣離子水平。 本研究發(fā)現(xiàn)U73122 可以顯著抑制胞內(nèi)鈣離子水平的增加,同時(shí),U73122 也可以逆轉(zhuǎn)EGF 介導(dǎo)的胞內(nèi)cGMP 水平下降。 結(jié)合前期研究結(jié)果,PLC 信號(hào)與鈣離子信號(hào)以EGFR 的胞內(nèi)區(qū)為靶點(diǎn)[16],本研究進(jìn)一步闡明了激活EGFR 通過(guò)PLCγ1/鈣離子導(dǎo)致NPR2 失活與減數(shù)分裂恢復(fù)。

LH 本質(zhì)上是通過(guò)激活EGFR 發(fā)揮作用的,本研究發(fā)現(xiàn)U73122 顯著抑制了LH 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù),說(shuō)明PLCγ1 在LH/EGFR 信號(hào)誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。 有研究表明,PLCγ1在小鼠胚胎中廣泛表達(dá),敲除小鼠PLCγ1 后,小鼠胚胎發(fā)育受到損傷[17],這可能是因?yàn)榍贸齈LCγ1影響卵子的正常發(fā)育。

激活PLC 產(chǎn)生的IP3是IP3R 鈣庫(kù)唯一的門(mén)控分子[18-19],而LH/EGFR 通過(guò)PLCγ1 導(dǎo)致的卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高需要IP3R 鈣庫(kù)的作用,IP3R具有3 種亞型,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Itpr1 mRNA 的表達(dá)水平在三種亞型中最高,另外,免疫組化與Western blot 均顯示IP3R1 在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞中表達(dá),IP3R1 鈣庫(kù)被動(dòng)員后釋放鈣離子,導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子水平升高,使NPR2 失活,本研究發(fā)現(xiàn)IP3R1 在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)豐度也比較高,可能是除了NPR2 主要在卵丘細(xì)胞外,也表達(dá)于顆粒細(xì)胞[20]。 上述結(jié)果綜合提示PLCγ1 通過(guò)IP3R1 升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,但I(xiàn)P3R1 究竟通過(guò)怎樣的機(jī)制調(diào)控卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究證實(shí)了LH/EGFR 信號(hào)通過(guò)PLCγ1-IP3R1 通路升高卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,使NPR2 失活,cGMP 水平下降,誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。

致謝感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院張美佳教授提供實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所,感謝張美佳教授在論文寫(xiě)作過(guò)程中給予的指導(dǎo),感謝中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所唐鐵山教授贈(zèng)予抗體。