建立仙臺病毒實時熒光重組酶等溫擴增檢測方法

馮麗萍,熊 煒,高 誠,魏曉鋒?

(1. 上海實驗動物研究中心,上海 201203; 2. 上海海關,上海 200135)

20 世紀50 年代在日本仙臺發(fā)現(xiàn)仙臺病毒,該病毒是一種小鼠副流感病毒1 型,首先從用于傳代人類患者樣本的小鼠中分離到,引起病毒起源的混淆。 現(xiàn)在普遍認為仙臺病毒是小鼠的病原體,而不是人類的。 仙臺病毒是副粘病毒屬的成員,與其他副粘病毒一樣,它也是一種包膜病毒,具有非分段的負鏈RNA 基因組[1]。 仙臺病毒可自然感染小鼠并引起小鼠肺炎或呈隱性感染,干擾實驗結果,需要被嚴格控制。 國標規(guī)定清潔級和SPF 級實驗小鼠必須定期檢測仙臺病毒,目前國標檢測方法主要是血清學檢測方法,包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),免疫酶試驗(IEA),血凝抑制試驗(HAI)和免疫熒光試驗(IFA)等[2]。 這些方法通常耗時費力,靈敏度低。 隨著分子檢測技術的進步,大量基于基因擴增的分析應用于檢測仙臺病毒[3-5],如逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),實時PCR,環(huán)介導等溫擴增(LAMP)等。 此類方法需要昂貴的熱循環(huán)儀和經(jīng)驗豐富的技術人員,檢測時間較長很難在現(xiàn)場實施。

本研究中實時熒光重組酶等溫擴增(real-time fluorescence recombinase polymerase amplification,real-time RPA)是一種快速靈敏的分子檢測方法,適用于現(xiàn)場檢測。 近年來已經(jīng)成功開發(fā)多種實時熒光RPA 檢測方法,用于快速檢測不同病原體檢測,如空腸彎曲桿菌、豬圓環(huán)病毒2 型、口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、單核細胞增生李斯特氏菌等[6-10]。該方法可通過簡單的儀器在25 min 甚至更短的時間內進行實時檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SeV 及陽性核酸來自本實驗室保存。 本研究中使用的其他病原微生物如小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)、呼腸孤病毒Ⅲ型(reovirus type III, Reo-3)、 肺 炎 克 雷 伯 桿 菌(Klebsiella pneumoniae, KP)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)、 嗜 肺 巴 斯 德 桿 菌( Pasteurella pneumotropica, PP )、 綠 膿 桿 菌( Pseudomonas aeruginosa, PA)等來自本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

DNA Marker(DL1000)、RNA 酶抑制劑、dNTP、反轉錄試劑盒等購自TaKaRa 公司;病毒RNA 快速抽提試劑盒購自生工生物公司;TwistAmp exo 試劑盒購自英國TwistDx 公司;Genie? II 等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)購自英國OptiGene 公司;PCR 儀Biometra T-gradient Thermoblock; 凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad Universal Hood II。

1.3 實驗方法

1.3.1 核酸提取及模板制備

核酸提取：取0. 2 mL 待檢上清液或血清,加0. 6 mL buffer Rlysis-VG 試劑進行RNA 提取,室溫放置10 min,震蕩后加入0. 7 mL 異丙醇;離心15 min 后移除上清;加入1 mL 70%乙醇,震蕩后離心5 min,移除上清;加入0. 2 mL RNase-free 水溶解RNA 沉淀,樣品可直接取用,也可以保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

模板制備：取2 μL RNA 溶液,dNTP Mixture 1 μL、隨機引物1 μL、RNase-free H2O 6 μL,PCR 儀上變性、退火反應：65℃5 min;4℃。 在此反應液中加入buffer 4 μL、RNA 酶抑制劑0.5 μL、RTase 0.5 μL、RNase-free H2O 5 μL,再次放回PCR 儀進行反轉錄反應：30℃10 min;42℃30 min;95℃5 min;4℃,即得cDNA 模板,樣品可直接取用,也可以保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實時熒光RPA 引物及探針設計

針對SeV 融合蛋白編碼基因的保守序列設計引物及探針[1],實時熒光RPA 檢測引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。 上游引物SENVFP： 5’-AAA TCT ATA GAA CTG CTG CAA AAC GCT GTG GG-3’;下游引物SENV-RP： 5’-TTG TGT CAG TTT TAT CCC CAG TCT TAA AGC GG-3’;RPA探針SENV-P： 5’-GAA CAA ATT CTT GCT CTA AAG ACG CTC CAG GAT (FAM) -T-T(BHQ1) CGT GAA TGA TGA GAT CAA AC-PO4-3’。

1.3.3 實時熒光RPA 反應體系及程序

反應體系為：使用TwistAmp exo 干粉試劑盒,總體積50 μL,29.5 μL 反應緩沖液、上下游引物各2.1 μL、10 μmol/L 熒光探針0.6 μL、模板2 μL、水11.2 μL,將預混液混合均勻;使用微型旋轉離心機快速離心,混勻后加入干粉中;最后加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂,小心關閉蓋子,上下顛倒混合10次,離心20 s。 參照說明書TwistAmp exo quick guide part number： TAEXO02Guide/ Revision B 即可。

反應程序為：39℃孵育25 min。 反應中即可同步呈現(xiàn)熒光擴增曲線,根據(jù)曲線進行結果判定。

1.3.4 SeV 實時熒光RPA 方法特性的分析

特異性分析：將SeV cDNA 和其他對照病原微生物(小鼠肝炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等),以及空白對照組(雙蒸水替代模板),使用SeV實時熒光RPA 方法擴增,觀察結果。

敏感性分析：將SeV cDNA 進行10 倍倍比稀釋,獲得濃度范圍是100 ng/μL 到100 fg/μL 的濃度梯度,和空白對照組同時使用SeV 實時熒光RPA方法擴增,觀察隨時間推移的熒光信號累積。

穩(wěn)定性和可靠性分析：在不同時間進行7 次獨立的實時熒光RPA 檢測,模板濃度范圍是100 ng/μL 到100 fg/μL 的10 倍倍比稀釋的濃度梯度,觀察檢出濃度及檢出時間,并進行統(tǒng)計分析。 檢出率應用SPSS 在線Probit 回歸分析。 峰值時間應用Microsoft Excel 軟件線性回歸分析。

1.3.5 實時熒光RPA 方法的優(yōu)勢比較

選擇實驗動物仙臺病毒PCR 檢測方法的團體標準進行優(yōu)勢比較[3],實時熒光RPA 方法與團體標準PCR 方法使用相同濃度的模板進行擴增,比較其兩種方法檢出濃度的下限,以及檢測全程所需的時間。

團體標準中的方法,PCR 上游引物Sev-F180 ∶5’-ATG AAG GAC AAA GCA TTA TCG CCT A-3’;上游引物Sev-R180 ∶5’-CAA CCA GTC TCC TGA TTC CAC GTA-3’。 PCR 反應體系和反應程序均參照團體標準[3]。

2 結果

2.1 實時熒光RPA 檢測SeV 的特異性和敏感性

SeV 核酸為單股負鏈RNA,選擇其融合蛋白編碼基因,設計特異性擴增引物及探針并建立SeV 實時熒光RPA 檢測方法。 為了評估方法的有效性及特異性,選用小鼠易感的小鼠肝炎病毒等六種病原微生物作為對照。 將所有的對照組和SeV 組同時擴增,SeV 在反應6 min 30 s 之后熒光信號迅速增強,而其他組在整個反應中均未觀察到可見的熒光信號(圖1)。 實驗結果表明實時熒光RPA 能特異性檢測SeV,無交叉反應。

本研究評估實時熒光RPA 的敏感性,使用10倍倍比稀釋SeV cDNA 制備濃度梯度100 ng/μL 到100 fg/μL,作為反應的模板。 實時熒光RPA 反應中,前四個梯度能隨著時間的推移有大量的熒光信號累積(圖2)。

圖1 實時熒光RPA 擴增中不同病原微生物的熒光信號Figure 1 Fluorescence data of different pathogenic microorganisms in real-time RPA amplification

圖2 實時熒光RPA 擴增中SeV 稀釋梯度的熒光信號Figure 2 Fluorescence data of a dilution series of SeV in real-time RPA amplification

2.2 實時熒光RPA 檢測方法的穩(wěn)定性和可靠性

基于7 次不同時間獨立的實時熒光RPA 檢測結果,建立回歸分析模型。 實驗中濃度范圍是100 ng/μL 到100 fg/μL 的濃度梯度,不同實驗中最低檢出濃度有一定波動,波動范圍在1 ng/μL 到10 pg/μL 之間,應用SPSS 在線Probit 回歸分析,預測濃度185 pg/μL 能達到95%檢出率(圖3),預測準確率為92.59%,達到此濃度水平實時熒光RPA 檢出率能有很好的穩(wěn)定性。

峰值時間建立線性回歸分析模型,大約出現(xiàn)在6～20 min 之間(圖4)。 從峰值時間來看,只要能檢出均在20 min 內獲知結果,超過20 min 還沒有起峰則全部未檢出,故本實驗設計25 min 可以覆蓋所有的有效結果,不會錯失陽性結果,故結合之前特異性實驗結果很好,可見達到其檢出濃度實時熒光RPA 方法不會錯判和漏判,可靠性很好。

2.3 實時熒光RPA 方法的優(yōu)勢比較

本研究PCR 方法為團體標準中的方法,反應模板濃度梯度100 ng/μL 到100 fg/μL 和實時熒光RPA 模板濃度梯度相同。 PCR 產(chǎn)物電泳圖中,前四個泳道可見目標條道(圖5)。 因此,如圖2 和圖5所示這兩種方法檢測下限一致。 PCR 反應完成需要100 min,跑膠及拍照耗時30 min,總計130 min,而實時熒光RPA 擴增和檢測信號是實時呈現(xiàn),全程僅需25 min,通常在6 ～20 min 之間即可觀察到結果,大大縮短了檢測時間。 另外,比起PCR 儀,實時熒光RPA 檢測儀Genie II,更加小巧輕便且自帶電池,適合現(xiàn)場檢測。

圖3 SeV 實時熒光RPA 方法的檢出率Figure 3 Positive detection rate of the SeV real-time RPA assay

圖4 SeV 實時熒光RPA 方法的峰值時間Figure 4 Peak time of the SeV real-time RPA assay

圖5 PCR 擴增SeV 稀釋梯度的電泳結果Figure 5 Electrophoretic results of a dilution series of SeV in PCR amplification

3 討 論

實時熒光RPA 已被廣泛用于多種病原體的分子檢測,便于實地檢測[11-12]。 本研究中開發(fā)了SeV實時熒光RPA 方法,其特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可靠性均可,該方法能夠快速靈敏的檢測出仙臺病毒。 實驗中SeV 實時熒光RPA 和PCR 方法檢測下限一樣,然而所需的時間相差很大,其中實時熒光RPA 全程僅需25 min,一般在6 ～20 min 內即可觀察到結果,而PCR 則需要130 min 才能知曉結果。此外,研究中使用的便攜式檢測儀Genie II,小巧輕便,無需連接電腦,儀器自帶電池,可全天戶外無電環(huán)境工作。 實時熒光RPA 干粉試劑盒操作簡單,僅需將引物、探針和模板DNA 伴隨反應混合液和緩沖液加入干粉中即可,減少污染。 重組酶將寡核苷酸引物與模板退火,形成穩(wěn)定的單鏈結合蛋白(SSB)結合的引物-重組酶復合物,不需要初始熱變性步驟來解開雙鏈DNA[13]。 總而言之,SeV 實時熒光RPA方法簡單,快速,便攜等特性,使其特別適用于在資源有限的環(huán)境中對可疑樣品的現(xiàn)場篩查,對于實驗動物質量控制具有重要的意義。