紫芝子實(shí)體細(xì)胞壁多糖的特征分析

顏夢(mèng)秋，劉艷芳，唐慶九，吳 迪，李德順，高 坤，楊 焱，張勁松*

（1上海海洋大學(xué)，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海201403）

紫芝（Ganodermasinense），又稱(chēng)黑芝、玄芝、木芝、中國(guó)靈芝，屬擔(dān)子菌門(mén)傘菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬，與赤芝同為靈芝正品。紫芝在中國(guó)古代早有藥用記載，具有治耳聾、利關(guān)節(jié)、保神、益精氣、堅(jiān)筋骨的作用?，F(xiàn)代研究表明，紫芝中主要功能成分為多糖、三萜、生物堿等［1］。紫芝多糖是紫芝中起免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的重要功能因子，研究表明紫芝多糖具有抗炎鎮(zhèn)痛［2-3］、免疫調(diào)節(jié)［4-5］、抗腫瘤［6］、抗氧化［5，7-8］以及調(diào)節(jié)腸道微生物［4］等活性。

目前，對(duì)紫芝多糖的研究主要集中在多糖的提取方法優(yōu)化和純化工藝改進(jìn)方面，現(xiàn)已從紫芝中分離獲得20多個(gè)多糖組分［9］，分子量分布較為寬泛，主要為103—106級(jí)。這類(lèi)多糖中的大分子量多糖（106級(jí)）主要由葡萄糖組成［9-10］；中等分子量多糖（105級(jí)）除含有葡萄糖外，還含有少量的甘露糖和半乳糖［11］；小分子量多糖（103—104級(jí)）主要由半乳糖、葡萄糖組成，還含有少量的巖藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸［5，12-13］。這些信息為紫芝水溶性胞內(nèi)多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于赤芝子實(shí)體，紫芝子實(shí)體中提取獲得水溶性多糖的得率較低［14-15］，提取剩余大量的殘?jiān)€未進(jìn)行有效利用。據(jù)報(bào)道［16］，食用菌細(xì)胞壁上含有豐富的多糖成分，可以通過(guò)酸堿提取或超微粉碎處理后進(jìn)一步加以利用。為了明確紫芝細(xì)胞壁多糖的特征，本研究以紫芝子實(shí)體水提殘?jiān)鼮檠芯繉?duì)象，通過(guò)超微粉碎、熱水浸提、分級(jí)醇沉得到紫芝細(xì)胞壁多糖樣品，并對(duì)其多糖得率、單糖組成、分子量分布等特征加以描述，為進(jìn)一步獲得紫芝細(xì)胞壁均一多糖和開(kāi)發(fā)相關(guān)功能產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫芝子實(shí)體（菌株編號(hào)305）產(chǎn)于浙江龍泉靈芝栽培基地，60℃烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎后備用。

單糖標(biāo)品（D-果糖、D-葡萄糖胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸），三氟乙酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

粉碎機(jī)（上海淀久公司，DJ-10A），MS105DU分析天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）、臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）、Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tex公司）、ICS-2500型高效離子色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）、Waters 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）、Waters 2414示差折光檢測(cè)儀（美國(guó)Waters公司）、八角度激光光散射儀（美國(guó)Wyatt公司）。

1.3 紫芝子實(shí)體細(xì)胞壁多糖的提取

稱(chēng)取2 000 g紫芝子實(shí)體粗顆粒（直徑約5 mm），以1∶10（kg/L）料液比加入蒸餾水，沸水提取2 h。取10 mL提取液離心，上清液通過(guò)苯酚-硫酸法［17］測(cè)總糖。重復(fù)以上提取步驟直至苯酚硫酸法測(cè)出的上清液不含糖時(shí)（共提取6次），停止提取。濾布過(guò)濾提取液，將提取后的殘?jiān)娓?、超微粉碎?00目（0.075 mm孔徑）粉末。稱(chēng)取1 300 g紫芝超微粉碎末，加入蒸餾水，使料液比為1∶10，沸水浴提取2 h，濾布過(guò)濾后，將提取液在10 000g條件下離心20 min，再次以200目（0.075 mm孔徑）4層濾布過(guò)濾，保留上清，離心所得的殘?jiān)c濾布過(guò)濾濾渣合并，按上述提取方法再提取2次，過(guò)濾、離心，合并3次提取上清液，真空減壓濃縮至1.3 L（濃縮比1∶1）。

1.4 紫芝子實(shí)體細(xì)胞壁粗多糖的制備

在1.3 L的濃縮液中邊攪拌邊加入無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到30%（V/V，下同），4℃靜置過(guò)夜，10 000g離心30 min后，分別收集沉淀和上清，沉淀用蒸餾水溶解后，90℃水浴揮干乙醇，真空冷凍干燥，命名為GSCW30E。上清進(jìn)一步邊攪拌邊加入無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到50%，按照上述操作靜置過(guò)夜，離心，沉淀水溶凍干后得GSCW50E。上清進(jìn)一步加入無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到70%，按照上述操作靜置過(guò)夜，離心，沉淀水溶凍干后得GSCW70E。上清液經(jīng)真空減壓濃縮后，90℃水浴揮干乙醇凍干后命名為GSCW70EU。得到的4個(gè)組分凍干后稱(chēng)重，計(jì)算多糖的提取得率。

1.5 多糖含量測(cè)定

參照左琦等［17］，使用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中的多糖含量。

1.6 單糖組成分析

參照Z(yǔ)hou等［18］，采用高效陰離子色譜法，以11種單糖混合標(biāo)品為對(duì)照，測(cè)定樣品的單糖組成及不同單糖的摩爾分?jǐn)?shù)。

1.7 多糖分子量分布測(cè)定

采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散射儀-示差折光檢測(cè)儀（High performance size exclusion chromatography-multiple angle laser light scattering detector-refractive index detector，HPSEC-MALLS-RI）聯(lián)用［19］分析多糖的分子量分布范圍。根據(jù)色譜柱的檢測(cè)范圍，檢測(cè)GSCW30E和GSCW50E的色譜柱條件為T(mén)SKgel G6000PWXL（7.8mm×30 cm）和TSKgel G4000PWXL（7.8mm×30 cm）串聯(lián)聯(lián)用；檢測(cè)GSCW70E和GSCW70EU的色譜柱條件為T(mén)SKgel G4000PWXL（7.8 mm×30 cm）和 TSKgel G2500PWXL（7.8 mm×30 cm）串聯(lián)聯(lián)用，緩沖條件為0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4（含有0.02%疊氮鈉，pH調(diào)為7.00）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分步醇沉各組分得率和多糖含量

經(jīng)過(guò)分步醇沉得到不同粗多糖組分的總得率為2.00%（表1），其中GSCW70EU的得率最高為1.00%，GSCW70E和GSCW30E的得率相近分別為0.51%和0.40%，GSCW50E的得率只有0.08%。從多糖含量上看，4個(gè)組分的多糖含量都較高，其中GSCW30E和GSCW70E的多糖含量分別高達(dá)98.99%和97.17%。

表1 分步醇沉各組分得率和多糖含量Table 1 The yield and content of crude polysaccharides fractions by stepw ise ethanol precipitation of fruiting body cell wall of Ganoderma sinense %

2.2 單糖組成分析

運(yùn)用高效陰離子色譜檢測(cè)分步醇沉的單糖組成及其摩爾分?jǐn)?shù)，以11種單糖混合標(biāo)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和對(duì)照。由表2可知，4個(gè)多糖組分均主要由葡萄糖組成，其摩爾分?jǐn)?shù)為78.26%—94.48%，其中GSCW30E和GSCW50E中的葡萄糖占比最高，均超過(guò)90%。除葡萄糖外，各組分還含有少量的木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸以及巖藻糖和葡萄糖胺等單糖，各單糖在不同組分中的比例有所不同。

表2 分步醇沉各組分的單糖組成摩爾分?jǐn)?shù)Table 2 M olar ratio ofmonosaccharide of crude polysaccharide fractions by stepw ise ethanol precipitation %

2.3 多糖的分子量分布

由表3可見(jiàn)，紫芝子實(shí)體胞壁多糖的分子量分布范圍較廣，其重均分子量范圍從0.8×104—135.7×104g/mol，并呈現(xiàn)隨著乙醇濃度的增加，所得沉淀組分分子量逐漸變小的規(guī)律。GSCW30E為大分子量組分，其重均分子量為135.7×104g/mol；GSCW50E包含兩個(gè)組分（圖1峰B和峰C），重均分子量分別為132.0×104g/mol和7.5×104g/mol，其中以分子量較小的峰C為主，峰B的分子量與GSCW30E的重均分子量相近，可能是30%乙醇沉淀不完全導(dǎo)致大分子量多糖出現(xiàn)在50%醇沉組分中；GSCW70E和GSCW70EU均為小分子量組分，其重均分子量分別為2.1×104g/mol和0.8×104g/mol。紫芝細(xì)胞壁多糖各組分的多分散性系數(shù)為1.2—1.9，為窄分布。

表3 分步醇沉各組分粗多糖的分子量分布特征Table 3 Molecular weight distribution of crude polysaccharide samples obtained by stepwise ethanol precipitation

圖1 分步醇沉所得粗多糖的HPSEC圖譜Fig.1 HPSEC spectra of crude G.sinense cellwall polysaccharide samp les obtained by stepw ise ethanol precipitation

3 結(jié)論與討論

研究表明，真菌細(xì)胞壁主要由多糖組成［16］，多通過(guò)冷凍研磨、高壓均質(zhì)、酸堿提取、高溫處理等方法提?。?9］并進(jìn)一步利用。目前對(duì)酵母細(xì)胞壁多糖的研究較多，而關(guān)于食藥用菌細(xì)胞壁多糖研究較少。本研究通過(guò)對(duì)紫芝子實(shí)體水提殘?jiān)M(jìn)行超微粉碎后再經(jīng)水提醇沉得到細(xì)胞壁多糖組分，總得率達(dá)到2%，明顯高于紫芝子實(shí)體水溶性胞內(nèi)多糖的提取得率，同時(shí)細(xì)胞壁多糖各組分的多糖含量（75.33%—98.99%）也顯著高于紫芝子實(shí)體水溶性胞內(nèi)多糖各組分的多糖含量（27.78%—47.20%），說(shuō)明紫芝細(xì)胞壁上多糖含量較豐富，獲得的較高純度的多糖也更利于后續(xù)的分離純化。另外，單糖組成分析比較結(jié)果顯示，紫芝細(xì)胞壁多糖與其水溶性胞內(nèi)多糖在單糖組成特征上有所不同，細(xì)胞壁多糖除了具有與胞內(nèi)多糖相同的五種單糖（巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖）外，還含有少量的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸；且胞內(nèi)多糖中以葡萄糖和半乳糖含量較高，而細(xì)胞壁多糖中以葡萄糖為主。對(duì)細(xì)胞壁多糖的結(jié)構(gòu)解析將在后續(xù)工作中進(jìn)行。

據(jù)報(bào)道，紫芝菌絲體和子實(shí)體多糖都有較好的增強(qiáng)免疫活性，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌［20］，也有研究表明猴頭菌細(xì)胞壁多糖具有刺激鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的作用［21］。因此，本研究過(guò)程中也考察了四種細(xì)胞壁多糖組分刺激小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7分泌NO的作用，以及對(duì)分化的THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的影響，結(jié)果顯示四種組分均無(wú)明顯作用，初步判斷紫芝細(xì)胞壁多糖的體外活性不同于菌絲體多糖和子實(shí)體多糖［22］，其生物活性有待進(jìn)一步研究。