鑒別紫芝菌株的PCR 引物篩選及其序列比對驗證

鐘禮義，陳體強，劉新銳，應(yīng)正河，楊 馳

（1.福建武平縣食用菌技術(shù)推廣服務(wù)站，福建 武平 364300；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州350014；3.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】靈芝的商品化栽培（規(guī)范化種植）起源于20 世紀(jì)90 年代，福建省曾大力推廣以赤芝6 號等為代表的優(yōu)良栽培菌株[1-2]，成為國內(nèi)最大的靈芝生產(chǎn)與出口基地。但2000 年以來，福建靈芝種植業(yè)受國家林業(yè)政策等影響，栽培用材短缺難以維持商品化種植的需求（人工培育靈芝專用林的成材期長達(dá)10—12 年），栽培量一落千丈。同時，長期以來人工栽培和加工利用的靈芝種類（品種）單一，難以滿足多樣化的市場需要，產(chǎn)業(yè)發(fā)展缺乏新的增長點。而野生紫芝種質(zhì)資源的開發(fā)利用及其人工馴化栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用，可再次促進福建省靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，能成為山區(qū)扶貧致富的好項目。福建省靈芝科真菌資源中靈芝屬的紫芝類（Sect.Phaeonema）有9 種[3]，其代表性種類是被稱為中國靈芝的紫芝（G.sinense）、其近緣種的硬孔靈芝（G.duropora）[4]，這2 種紫芝常見于閩西北山區(qū)?！厩叭搜芯窟M展】紫芝是靈芝科靈芝屬（Ganoderma）的重要類群紫芝組（Sect.Phaeonema），其特征是菌肉呈均勻褐色、深褐色至栗褐色；以Ganoderma sinense為中心的紫芝大種群是屬于高溫多雨氣候型，分布在長江以南的8 個省區(qū)[5]。相較于栽培較廣泛的赤芝（G.1ucidum）與松杉靈芝（G.tsugae），紫芝種質(zhì)資源的開發(fā)利用相對滯后，市場上的靈芝或者靈芝類產(chǎn)品很少以紫芝為主要原料[6]。紫芝作為中藥材靈芝來源菌物，自2000 年起被《中國藥典》收錄，但其栽培種質(zhì)資源與遺傳育種方面的研究報道較少，亟待加強。目前，我國人工栽培的紫芝菌種主要還是野外分離和馴化的菌株[7]，如閩紫96 和紫芝S2[8-9]。這2 個栽培菌株在栽培性狀（朵型、大?。┗蜃訉嶓w發(fā)育形態(tài)上有著很大的不同，其中閩紫96 菌蓋小型，菌柄側(cè)生、偏生為主，栽培單產(chǎn)僅有12.70 kg· m-3（干 品/菌 材），而 紫 芝S2 菌蓋 大 型，菌柄中生、近中生，栽培單產(chǎn)平均可達(dá)25.05 kg·m-3（干品/菌材）。國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)（微觀和宏觀）形態(tài)特征上的不同，早在2005 年就描述了紫芝（G.sinense）的表型可塑性[10]，且基于系統(tǒng)發(fā)育分析，已有研究者提出將硬孔靈芝（G.duropora）與紫芝（G.sinense）歸類為一個新的復(fù)合種——紫芝（Ganoderma duroporum comb.nov.）[11]。最近，來自中國境內(nèi)不同產(chǎn)地的具有高度表型可塑性的20 份紫芝標(biāo)本，從多基因序列比對結(jié)果也被證實為同一種[12]?！颈狙芯壳腥朦c】經(jīng)多年多點區(qū)域試驗和Finlay 穩(wěn)定性分析，紫芝S2 受栽培環(huán)境因素影響較?。ǚ€(wěn)定性好，適應(yīng)性強），于2012 年獲得新品種認(rèn)定（品種認(rèn)定號：閩認(rèn)菌2012002），定名為武芝2 號[13]。紫芝S2 適于林下種植與大棚栽培，已在福建省閩西北推廣應(yīng)用多年，年產(chǎn)量可達(dá)300 t；近年來，紫芝S2 已經(jīng)被引種至廣東、廣西、江西和浙江等省份，遼寧、黑龍江也有星零種植。為了避免與其他來源（遺傳背景不同）栽培菌的株系混雜，本研究采用RAPD-PCR、ISSR-PCR 技術(shù)構(gòu)建紫芝S2（Zizhi S2）的分子標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用Primer-Blast 在線設(shè)計，將篩選得到的特異性PCR 引物短序列與紫芝S2 基因組全序列進行Blast 比對，反向驗證其有效性，為紫芝菌株鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從不同單位得到的6 個紫芝栽培常用紫菌株（表1）。其中，1 號菌株紫芝S2 和2 號菌株紫芝X5均由福建省武平縣食用菌技術(shù)推廣服務(wù)站選育提供。紫芝S2 與紫芝X5、紫芝1、紫芝2、紫芝3、紫芝4等其他5 個菌株間均存在不同度的拮抗現(xiàn)象，菌絲表面形成帶狀拮抗線（圖1）。

表1 供試紫芝菌株信息Table 1 Strains of cultivated Zizhi used in study

1.2 DNA 樣品提取與檢測

將供試菌株分別接種到貼有玻璃紙的PDA 平板中，封口倒置、于27 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿平板收集菌絲，于預(yù)冷研缽中加入液氮研磨成細(xì)粉，采用改良CTAB法提取和純化總DNA[14]。采用0.75%瓊脂糖凝膠電泳（100 V 直流1 h，5～80 kb 脈沖16 h）檢測DNA樣品符合建庫合格，Nanodrop 檢測DNA 純度（161.6 ng·μL-1），Qubit 快速熒光定量（154.0 ng·μL-1）。

1.3 RAPD、ISSR 擴增分析比較

采用Eppendorf Mastercyeter Personal PCR 擴增儀，PCR 試劑購自TaKaRa 有限公司（大連），候選RAPD、ISSR 擴增引物均從（上海）生工生物工程股份有限公司提供的引物產(chǎn)品中篩選，PCR 反應(yīng)體系及擴增程序按照參考文獻[14]。反應(yīng)結(jié)束后，各取5 μL PCR 產(chǎn)物，加1 μL 溴酚藍(lán)（6×）混勻，在1.0%瓊脂糖凝膠（含Goldview TMDNA 染料0.5 μg·mL-1）上電泳，使用Marker 為DL2000，于4～5 V·cm-1電壓下電泳約1.0 h，在JS-680 全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照保存。

1.4 引物序列與基因組序列的比對

采用PacBio Sequel 三代測序平臺完成紫芝S2 全基因組測序，組裝得到72 條Scaffold（其中核基因組71 條，另文報道）；Blast 比對（BLAST, v2.2.26）檢測每條Scaffold 上是否包含RAPD、ISSR 引物的短序列，并統(tǒng)計不同錯配比對結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理方法

多態(tài)位點百分率計算公式為P =（k/n）×100%，k 為多態(tài)位點數(shù)，n 為檢測位點總數(shù)；遺傳相似距離計算采用Nei 氏公式S = 2Nxy/（Nx+ Ny），其中Nxy為菌株X 和Y 共有片段數(shù)，Nx、Ny分別為X 和Y 菌株擴增片段總數(shù)。采用NTSYSpc2.0 軟件對菌株RAPD、ISSR 分子標(biāo)記結(jié)果進行UPGMA 聚類分析，生成供試菌株的遺傳聚類關(guān)系圖。選取比對允許空位數(shù)為0 的Blast 結(jié)果（比對分?jǐn)?shù)值Score 越大越好，e 值越小越好），采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，分成比對允許錯配為0 和1（即Gap=0；Mismatch=0, 1）兩類結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒別菌株的分子標(biāo)記短序列

篩選到2 個RAPD 引物：S1506（GGTGGCCA AG）和S1326（AGGCATCGTG），其擴增效果較好、重復(fù)性高，能穩(wěn)定地擴增出特異性的條帶；其中，在紫芝S2、X5 的圖譜中分別呈現(xiàn)明顯區(qū)別的1～3特異性條帶，并且與4 個對照菌株的條帶均能明顯差異（圖2）。同時，還篩選到3 個ISSR 引物：ISSR1（C ACCACACACACACACA）、ISSR2（AGAGACAGAG AGAGAGT）和ISSR13（TTCCCTTCCTTCCC），其擴增效果好、條帶清晰且穩(wěn)定，呈現(xiàn)多態(tài)性；共擴增出87 條帶，其中表現(xiàn)出多態(tài)性的條帶為59 條，多態(tài)位點百分率為67.82%。其中，紫芝S2、X5 彼此間呈現(xiàn)1～3 條特異性條帶，也能與4 個對照菌株的條帶明顯區(qū)別開來（圖3）。分析結(jié)果表明：采用S1506、S1326、ISSR1、ISSR2、ISSR13 共5 個短序列引物，擴增得到RAPD 和ISSR 圖譜，均能夠簡單而有效地將紫芝S2 與其他紫芝菌株鑒別，可以考慮用于分子標(biāo)記。

圖1 紫芝菌株間的拮抗現(xiàn)象Fig.1 Antagonism between different Zizhi strains

圖2 RAPD-PCR 擴增圖譜Fig.2 RAPD-PCR amplifications

2.2 不同紫芝菌株間的遺傳距離

通過聚類分析建立遺傳相似距離矩陣，得到聚類圖（圖4）。結(jié)果表明，6 株菌株相互間的遺傳相似距離在0.564～0.836；其中，1 號菌株（紫芝S2）與4 號菌株（紫芝2）之間的親緣關(guān)系最近，而與5 號菌株（紫芝3）之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。已知紫芝S2 與紫芝2 之間拮抗不明顯，而與紫芝3 之間拮抗明顯（圖1），這2 個試驗結(jié)果相印證。

2.3 RAPD 和ISSR 引物序列與基因組的比對結(jié)果

圖3 ISSR -PCR 擴增圖譜Fig.3 ISSR-PCR amplifications

圖4 紫芝菌株的遺傳聚類圖Fig.4 Clustering dendrogram of Zizhi strains

將篩選得到5 個引物短序列（標(biāo)為*_堿基數(shù)：S1506_10、S132610、ISSR1-17、ISSR2_17 和ISSR13_14）與紫芝S2 的基因組序列進行Blast 比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除ISSR1_17 外，其他4 個引物都能比對上，均在基因組中不同Scaffold 上的多個位點找到與引物相匹配的序列片段（表2）。在允許一個（單堿基）錯配或空位情況下，在18 條Scaffold 上有31 個片段（17 bp）與ISSRPCR 引物ISSR2_17 相匹配（Identity=93.75～94.12），同時在18 條Scaffold 上找到31 個片段（14 bp）與ISSR13_14（完全匹配Identity=100），在48 條Scaffold上找到158 個片段（10 bp）與S1326_10 匹配（Identity=100%），在47 條Scaffold 上找到172 個片段（10 bp）與S1506_10（Identity=100%）相匹配。如不允許錯配或空位，則在5 條Scaffold 上有6 個片段（14 bp）與引物ISSR13_14 完全匹配（Identity=100%），在48 條Scaffold 上發(fā)現(xiàn)共有158 個片段（10 bp）與引物S1326_10 完全匹配，在47 條Scaffold 上共有172個位點片段（10 堿基）與S1506_10 完全匹配。因此，本研究最終推薦ISSR13、S1326 和S1506 這3 個PCR 引物作為鑒別紫芝菌株的分子標(biāo)記。

表2 PCR 引物與基因組比對結(jié)果Table 2 Blast result of PCR primer sequences on genomes

3 討論與結(jié)論

已知在靈芝屬藥用真菌的遺傳多樣性研究中可以通過拮抗反應(yīng)進行初步分類，然后再通過分子生物學(xué)的方法進行深入研究[15～17]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫芝S2 菌株與其他紫芝菌株之間存在拮抗反應(yīng)，遺傳背景明顯不同的個體在菌絲交界區(qū)會形成明顯的拮抗線，可以據(jù)此進行少量紫芝菌株的初步分類與鑒別；但當(dāng)菌株數(shù)量眾多時，工作量大且無法量化而不適用。本研究通過篩選到有價值的2～3 個RAPD/ISSR 引物，PCR 擴增得到的DNA 片段呈現(xiàn)條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性和特異性的電泳指紋圖譜，可用于紫芝新品種武芝二號（紫芝S2）與其他5 個紫芝菌株的鑒別。在此基礎(chǔ)上，通過遺傳距離確定其親緣關(guān)系，與菌株間的拮抗反應(yīng)相一致；進一步通過與紫芝S2 菌株基因組序列比對，確認(rèn)利用其中3 個引物（ISSR13、S1326 和S1506）作為鑒別紫芝栽培品種或菌株簡單有效的分子標(biāo)記物。

2012 年以來公布的幾種靈芝核基因組[18～21]，其中組裝質(zhì)量高和注釋信息較完整的有赤芝基因組全序列總長43.29 Mb（82 條Scaffolds, 16 113 個蛋白質(zhì)編碼基因）[19]，紫芝基因組全序列總長48.96 Mb（69條Scaffolds, 15 688 個蛋白質(zhì)編碼基因）[20]；本研究同期完成紫芝S2 三代測序，組裝得到的核基因組序列全長56.76 Mb，包含71 條Scaffolds，注釋出16 681 蛋白質(zhì)編碼基因（另文報道）。在此基礎(chǔ)上，既可以基于靈芝基因組序列篩選出有效SSR 位點用于快捷、準(zhǔn)確地標(biāo)記區(qū)分靈芝菌株間親緣關(guān)系（另文報道），也可以將篩選得到的有效鑒別紫芝菌株的RAPD/ISSR-PCR 引物（短序列）與紫芝基因組序列進行Blast 比對驗證。

致謝：本研究依托特色食用菌繁育與栽培國家地方（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）聯(lián)合工程研究中心、福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心的科研平臺完成。