嘉寶果葉片對(duì)高血糖小鼠的降血糖作用

林寶妹，邱珊蓮，張樹(shù)河，張 帥，洪佳敏，張少平，鄭開(kāi)斌

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意義】嘉寶果（Myrciaria cauliflora），又名珍寶果、樹(shù)葡萄，是桃金娘科（Myrtaceae）擬愛(ài)神木屬（Myrciaria）熱帶亞熱帶常綠灌木，原產(chǎn)巴西，在當(dāng)?shù)氐姆N植歷史悠久[1]。嘉寶果葉片中含有大量的黃酮、多酚類植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，在抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶方面有突出的功效[2]。糖尿病是一種復(fù)雜的慢性代謝性疾病，以高血糖和包括糖、脂肪、蛋白質(zhì)等的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝紊亂為特征。持續(xù)升高的血糖和血脂引起機(jī)體眼部、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和血管等多部位功能異常，如視網(wǎng)膜損傷、腎病和中風(fēng)等并發(fā)癥[3-4]。氧化應(yīng)激是糖尿病多種慢性并發(fā)癥的不同發(fā)病機(jī)制的共同通路，抗氧化劑可阻斷氧化應(yīng)激損傷途徑，在糖尿病的治療中顯現(xiàn)出日益重要的作用[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從多種植物中提取的抗氧化物質(zhì)如多酚和黃酮可發(fā)揮降血糖作用[6-7]。玫瑰花富含鞣質(zhì)、原花青素和類黃酮等多酚類化合物，多酚含量可達(dá)14.67%[8]，是玫瑰花抗氧化、抗衰老和降血糖等多種功能的主要生理活性物質(zhì)。Liu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，以玫瑰花提取物每日灌胃處理糖尿病大鼠，4 周后，試驗(yàn)組大鼠體重恢復(fù)至正常大鼠水平，空腹血糖值、糖耐量和胰島素抵抗指數(shù)顯著低于模型組大鼠；此外，在玫瑰花提取物處理下，糖尿病大鼠的血液總膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸水平均有一定下降，表現(xiàn)出良好的降血糖和降血脂功能。柿子葉含有豐富的水溶性多酚，主要以原花青素為主，含量可達(dá)2.4%[10]。Jung 等[11]直接將柿子葉干燥粉碎后以5%（w/w）添加到高血糖小鼠的日料中，持續(xù)喂養(yǎng)5 周后，試驗(yàn)組小鼠空腹血糖以及血清、肝臟中的TG（甘油三酯）和TC（總膽固醇）顯著降低，肝臟脂肪小滴減少，升高的血清指標(biāo)有HDL-C（高密度脂蛋白-膽固醇）和脂聯(lián)素，說(shuō)明柿葉添加能有效降低血糖，改善脂質(zhì)代謝紊亂，減少肝臟脂質(zhì)沉著。嘉寶果果皮富含花青素、黃酮等酚類化合物[12]，總多酚含量可達(dá)55.63%[13]，將其果皮凍干粉直接添加入高血糖小鼠飲水中飼喂8 周后，發(fā)現(xiàn)大鼠血糖最高可降低19%，血漿中的血脂指標(biāo)如TG、TC、LDL-C（低密度脂蛋白-膽固醇）、VLDL-C（極低密度脂蛋白-膽固醇）等含量均有顯著降低，但是對(duì)HDL-C 含量影響較小[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】嘉寶果葉片含有豐富的多酚類化合物，總多酚含量可達(dá)33.84%[15]，推測(cè)嘉寶果葉片也具有體內(nèi)降糖功效，但其體內(nèi)降糖活性的相關(guān)研究報(bào)道極少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以靜脈注射STZ 的方法建立高血糖小鼠，以含不同添加劑量葉片的飼料飼喂高血糖小鼠，測(cè)定血糖及血脂等相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)嘉寶果葉片的降糖作用，為嘉寶果葉片的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試動(dòng)物：清潔級(jí)成年雄性KM 小鼠，體質(zhì)量（25±1）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：CXK（京）2019-0008。

供試普通飼料：試驗(yàn)動(dòng)物飼料（飼料代碼：1022），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，飼料生產(chǎn)許可證號(hào)：京飼證（2019）06076。

供試嘉寶果葉片：選用沙巴品種嘉寶果的嫩葉，采自福建龍海市惠昌樹(shù)葡萄專業(yè)合作社，隨機(jī)選取50 株樹(shù)齡為15 a 的健康植株剪取嫩葉。嫩葉位于枝條頂部，質(zhì)地柔嫩且葉脈不清晰，顏色嫩綠或淡紅。

試驗(yàn)試劑：鏈脲佐菌素，純度98%，美國(guó)Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、蔗糖：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

全自動(dòng)生化分析儀，iMagic-M7 型，深圳市庫(kù)貝爾生物科技有限公司；三諾血糖儀，GA-6 型，三諾集團(tuán)；分析天平，BS110S 型，德國(guó)Sartorius 集團(tuán)；電熱鼓風(fēng)干燥箱，GZX-9246MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；冷凍高速離心機(jī)，MIKRO-22R，德國(guó)Hettich。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 將采集的嘉寶果嫩葉于熱風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒質(zhì)量后用粉碎機(jī)粉碎40 s（28 000 r·min-1）再過(guò)40 目篩，備用。將嘉寶果嫩葉粉末按照不同的添加比例（1%、2%、4%和8%）直接添加入小鼠普通飼料中，制成含有不同嘉寶果嫩葉比例的供試飼料。

1.3.2 動(dòng)物模型制備 將90 只KM 雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)將小鼠分為正常對(duì)照組和糖尿病造模組，其中10 只為正常對(duì)照小鼠，剩余80 只作為糖尿病造模用。將正常對(duì)照組和造模組小鼠禁食不禁水12 h，造模組小鼠尾靜脈一次性注射STZ 造模，劑量為90 mg·kg-1；正常對(duì)照組小鼠則尾靜脈注射相同量的檸檬酸緩沖液。注射后7 d，各組小鼠禁食不禁水4 h，采用血糖儀以尾靜脈針刺采血的方法，檢測(cè)血糖水平，挑選血糖值在11.1～25.0 mmol·L-1的小鼠為高血糖模型小鼠。

1.3.3 分組及給藥 將成模的高血糖小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，包括模型對(duì)照組（飼喂普通飼料）、1%葉片添加組（飼喂含有1%嘉寶果葉片的普通飼料）、2%葉片添加組（飼喂含有2%嘉寶果葉片的普通飼料）、4%葉片添加組（飼喂含有4%嘉寶果葉片的普通飼料）、8%葉片添加組（飼喂含有8%嘉寶果葉片的普通飼料），以及正常對(duì)照組（飼喂普通飼料），各組小鼠均自由飲水?dāng)z食，共飼喂30 d。

1.3.4 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 在試驗(yàn)過(guò)程中，每日觀察動(dòng)物精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛色光澤度等，并在試驗(yàn)開(kāi)始、中期及結(jié)束時(shí)測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量。

1.3.5 空腹血糖及血脂指標(biāo)測(cè)定 將各組小鼠禁食不禁水4 h，以尾靜脈取血的方法，在試驗(yàn)開(kāi)始、中期及結(jié)束時(shí)測(cè)定小鼠的空腹血糖。飼喂30 d 后，禁食24 h，小鼠眼眶取血，常溫靜置40 min 后，于高速冷凍離心機(jī)中，12 000 r·min-1，15 min 離心分離上層血清。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TG、TC、HDL-C 和LDL-C 等血脂指標(biāo)。

1.3.6 血糖曲線下面積檢測(cè) 于試驗(yàn)結(jié)束前，將所有小鼠禁食不禁水4 h 后，正常對(duì)照組小鼠依次灌胃蔗糖，劑量為3 g·kg-1，該組第一只小鼠灌胃開(kāi)始時(shí)記為第0 min，并測(cè)定第30、120 min 的小鼠血糖值。其余各組小鼠均按照以上方法分別測(cè)定。血糖曲線下面積按照《功能食品功能評(píng)價(jià)原理與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法》[16]中的公式計(jì)算，具體如下：曲線下面積（AUC）=（0 min 血 糖+30 min 血 糖×4+120 min 血糖×3）×0.25。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行均值計(jì)算；采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘉寶果葉片處理對(duì)高血糖小鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間，正常對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，行動(dòng)活躍，皮毛光滑，隨體質(zhì)量增加，進(jìn)食量、飲水量相應(yīng)增加。模型組小鼠精神狀態(tài)較差，行動(dòng)較為遲緩，皮毛較不光滑，光澤度較差，飲水量增加較為明顯，體質(zhì)量降低。飼喂30 d 后，與正常對(duì)照組小鼠相比，嘉寶果葉片1%和2%添加組精神狀態(tài)較差，行動(dòng)較為遲緩，皮毛較不光滑，光澤度差，飲水量增加明顯；4%添加組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)量、皮毛狀態(tài)較好，飲水量介于正常對(duì)照組和2%添加組之間；8%添加組小鼠精神狀態(tài)良好、行動(dòng)較活躍、皮毛光滑，飲水量接近正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及嘉寶果葉片處理各組小鼠體質(zhì)量極顯著降低（P＜0.01）；4%和8%添加組小鼠體質(zhì)量極顯著高于模型組（P＜0.01），各組小鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)表1。

2.2 嘉寶果葉片處理對(duì)高血糖小鼠空腹血糖的影響

各組小鼠在試驗(yàn)期間的空腹血糖值變化如表2所示。采用尾靜脈注射STZ 后，小鼠血糖極顯著高于正常對(duì)照小鼠（P＜0.01）并高于11.1 mmol·L-1。試驗(yàn)開(kāi)始前，模型對(duì)照組及嘉寶果葉片處理組小鼠血糖值無(wú)顯著差異（P＞0.05），并全部高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。飼喂15 d（試驗(yàn)中期）后，與正常對(duì)照組小鼠比較，模型對(duì)照組及嘉寶果葉片處理組的小鼠空腹血糖值極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，8%葉片添加組小鼠的空腹血糖值極顯著降低（P＜0.01）。飼喂30 d（試驗(yàn)結(jié)束）后，與正常對(duì)照組小鼠比較，模型對(duì)照組及嘉寶果葉片處理各組的小鼠空腹血糖值仍極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，8%葉片添加組小鼠的血糖值繼續(xù)降低，達(dá)（14.99±2.79）mmol·L-1，極顯著低于其他葉片處理組和模型對(duì)照組（P＜0.01），且低于本組血糖起始值；其余各組小鼠FBG 值在試驗(yàn)期間持續(xù)上升，與模型對(duì)照組沒(méi)有差異（P＞0.05）。

表1 嘉寶果葉片對(duì)高血糖小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of jaboticaba leaves in feed on body weight of hypoglycemic mice

表2 嘉寶果葉片對(duì)高血糖小鼠空腹血糖的影響Table 2 Effect of jaboticaba leaves in feed on FBG in hyperglycemic mice

2.3 嘉寶果葉片處理對(duì)高血糖小鼠糖耐量的影響

各組小鼠糖負(fù)荷后血糖值變化如表3 所示。糖負(fù)荷后，各組小鼠的血糖值在30 min 內(nèi)快速升高，在30～120 min 內(nèi)開(kāi)始下降。與正常對(duì)照組小鼠比較，模型對(duì)照組及嘉寶果葉片處理各組的AUC 值極顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組小鼠比較，1%和2%添加組AUC 值無(wú)顯著差異（P＞0.05），4%和8%添加組AUC 值極顯著降低（P＜0.01），其中8%添加組的降低幅度最大，下降了35.73%；并且該組小鼠120 min 后的血糖值低于初始FBG。

2.4 嘉寶果葉片處理對(duì)高血糖小鼠血脂指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間各組小鼠血脂指標(biāo)變化情況如表4 所示。飼喂30 d 后，與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組的TC 和LDL-C 水平?jīng)]有顯著變化，而TG 水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C 水平極顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠相比，嘉寶果葉片處理各組的TC 無(wú)顯著變化；1%和2%葉片添加組的LDLC 水平極顯著降低（P＜0.01），4%葉片組小鼠的LDL-C 水平無(wú)顯著變化，8%葉片組的LDL-C 水平顯著升高（ P ＜0.05）；嘉寶果葉片處理各組均可顯著降低TG 水平（P＜0.05），1%和2%葉片添加組降至與正常對(duì)照組相近的水平；嘉寶果葉片處理各組的HDL-C 水平均極顯著上升（P＜0.01），并升至與正常對(duì)照組相近的水平。

3 討論與結(jié)論

改善糖尿病患者的高糖高脂狀況一直都是糖尿病治療的重要方向之一。目前糖尿病常用的治療手段主要為藥物干預(yù)，包括口服降糖藥和注射胰島素，但長(zhǎng)期使用合成藥物的患者常見(jiàn)胃腸道不適、皮疹、肝損傷等副作用[17]，而長(zhǎng)期使用胰島素也會(huì)引起患者視力下降、體重增加和低血糖等不良反應(yīng)[18]。因此，尋找安全有效的降糖成分成為降糖藥物開(kāi)發(fā)的新方向。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，嘉寶果葉片醇提取物具有良好的抗氧化和體外降糖作用[15]，但未對(duì)嘉寶果葉片的體內(nèi)降糖作用進(jìn)行研究。

表3 嘉寶果葉片對(duì)高血糖小鼠糖耐量的影響Table 3 Effect of jaboticaba leaves in feed on glucose tolerance of hyperglycemic mice

表4 嘉寶果葉片對(duì)高血糖小鼠血脂指標(biāo)的影響Table 4 Effect of jaboticaba leaves in feed on blood lipids in hyperglycemic mice

天然產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)的降糖作用可采用提取物或者植物直接添加的方法進(jìn)行測(cè)定[9,11]，本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嘉寶果葉片提取物對(duì)高血糖小鼠的降血糖作用較弱，因此，本研究采用直接將嘉寶果葉片添加入小鼠日料中，持續(xù)飼喂嘉寶果葉片30 d，并觀察各組小鼠的行為變化，測(cè)定各組小鼠血糖及血脂相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠出現(xiàn)較為明顯的“三多一少”癥狀，即飲水量增加、進(jìn)食量增加和體質(zhì)量減輕。與模型組小鼠相比，嘉寶果葉片處理組小鼠的飲水量、采食量逐漸減少，體質(zhì)量升高。嘉寶果葉片具有良好的自由基清除能力[2]，可能通過(guò)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減少胰島β 細(xì)胞的損傷，促進(jìn)葡萄糖的利用，從而緩解高血糖小鼠“三多一少”癥狀。

對(duì)糖尿病患者來(lái)說(shuō)，控制血糖是治療糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)鍵。研究表明，控制糖尿病患者的血糖可以預(yù)防和延緩糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19-20]。本研究中，飼喂含8%葉片飼料的高血糖小鼠的空腹血糖值逐漸下降，到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，該組空腹血糖濃度下降12.29%，與模型組相比，空腹血糖下降41.01%，優(yōu)于已報(bào)道的白子菜葉片[Gynura divaricata（Linn.）DC.]（34.75%）[21]和 柿 葉（Dispyros kaki Thunb）（24.39%）[22]的降糖效果，說(shuō)明將嘉寶果葉片添加到小鼠日料中進(jìn)行飼喂能夠有效控制高血糖小鼠的空腹血糖，對(duì)糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防有積極的作用。糖耐量異常是心血管疾病的危險(xiǎn)因子，通過(guò)糖負(fù)荷試驗(yàn)，可以初步了解胰島β 細(xì)胞的功能以及機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。本研究測(cè)定了小鼠糖負(fù)荷后2 h 內(nèi)血糖的AUC 值，結(jié)果顯示，嘉寶果葉片可改善高血糖小鼠的糖耐量，4%和8%葉片添加組小鼠的AUC 值均顯著低于模型組，葉片8%劑量添加組AUC 值比模型組降低了35.73%，超過(guò)桑葉（Morus alba L.）（34.91%）[23]和 大 葉 欖 仁 葉（Terminalia catappa L.）（31.98%）[24]降低AUC 值的效果。說(shuō)明嘉寶果葉片能改善糖負(fù)荷，提高機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。

糖脂代謝紊亂是糖尿病患者普遍存在的病理生理變化，是誘發(fā)糖尿病患者并發(fā)心腦血管疾病的危險(xiǎn)要素。本研究對(duì)嘉寶果葉片飼喂30 d 后的小鼠血脂指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，TC 及LDL-C 的含量在各組小鼠間差異較小，但TG 及HDL-C 的水平則有較大的差異。嘉寶果葉片1%和2%劑量添加組可極顯著降低TG 水平（P＜0.01），且與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.01）；各嘉寶果葉片處理組均可升高HDL-C 水平，與正常組無(wú)顯著差異（P＞0.01）。說(shuō)明嘉寶果葉片對(duì)高血糖小鼠脂質(zhì)代謝紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用，并以中、低劑量組為佳，這可能是因?yàn)楦邉┝咳~片更強(qiáng)地抑制升血脂的靶標(biāo)物質(zhì)，引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，激活了其他可升高血脂的代謝通路。

本研究以STZ 誘導(dǎo)的高血糖小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)小鼠的血糖及血脂等指標(biāo)，結(jié)果表明，嘉寶果葉片能降低高血糖小鼠的空腹血糖，改善糖耐量和脂質(zhì)代謝紊亂，該試驗(yàn)結(jié)果可為今后嘉寶果葉片的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

致謝：特別感謝亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究室張定山同志在本研究的小鼠飼養(yǎng)、日常指標(biāo)觀察過(guò)程中給予的幫助。