油梨根際AM 真菌多樣性與土壤養(yǎng)分相關(guān)性分析

黃 婷，王明元，秦紫藝，劉昕煒，徐志周，孫 越，劉紫萱，董 濤

（1.華僑大學(xué)園藝科學(xué)與工程研究中心，福建 廈門 361021；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

0 引言

【研究意義】油梨（Perseaamericana Mill）又名牛油果、幸福果、樟梨等，原產(chǎn)于拉丁美洲，我國臺(tái)灣、海南、廣東、福建、廣西、云南的大部分地區(qū)均可種植。油梨果實(shí)富含脂肪酸，被譽(yù)為“森林黃油”[1]，在醫(yī)療保健方面，具有清除有害膽固醇、軟化血管、抗老化、降血脂等多種功效[2]。在食品加工方面，油梨油具有不易被氧化，可高溫加熱而不冒煙的特點(diǎn)。我國自20 世紀(jì)初開始引進(jìn)油梨，直到近幾年才引起廣泛關(guān)注。盡管國內(nèi)油梨消費(fèi)劇增，卻仍然主要依賴進(jìn)口，2010—2016 年間我國油梨進(jìn)口量從1.9 t 增長至2.5 萬t，進(jìn)口幅度成指數(shù)增長[3]，這主要是因?yàn)槲覈屠娣N植面積及產(chǎn)量品質(zhì)不能滿足國內(nèi)市場(chǎng)的需求[4]。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal, AM）真菌是一類在土壤中廣泛存在的微生物，能夠與大多數(shù)植物根系形成共生結(jié)構(gòu)，促進(jìn)宿主植物生長，提高植物的產(chǎn)量[5]、抗逆性[6]，增強(qiáng)植物利用水分與礦質(zhì)營養(yǎng)的能力[7]。當(dāng)前我國發(fā)現(xiàn)并保藏的AM 真菌共有190 多種[8]。AM 真菌的分布受土壤因子、地理因子、氣候因子、宿主植物與人為干擾因素的影響，其中的非生物因子，尤其是土壤因子的影響最為顯著[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有許多研究表明了火龍果[10]、獼猴桃[11]等多種植物的根際AM 真菌多樣性與土壤因子密切相關(guān)，如火龍果根系A(chǔ)M 真菌孢子密度與土壤有機(jī)質(zhì)、水解氮、全氮呈顯著正相關(guān)，而多樣性指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)；而獼猴桃根系A(chǔ)M 真菌孢子密度與土壤速效磷呈顯著正相關(guān)、與全氮呈極顯著負(fù)相關(guān)、與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)。當(dāng)前關(guān)于油梨的研究主要集中在栽培、選種、貯藏與營養(yǎng)價(jià)值及醫(yī)療保健等方面，關(guān)于油梨的生態(tài)學(xué)適應(yīng)性方面的研究很少[12]。Tamayo 等[13]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)或共同接種解磷菌（Mortierella sp.）與AM 真菌（Rhizoglomusfasciculatum）都可以促進(jìn)油梨對(duì)磷元素的吸收以及地上部生長，且共同接種比單一接種促進(jìn)效果更佳。目前尚未見有關(guān)于油梨根際AM 真菌多樣性以及其與土壤養(yǎng)分因子相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】本研究采集我國主產(chǎn)區(qū)油梨根際土壤，分析油梨根際AM 真菌多樣性，以及與土壤相關(guān)理化性質(zhì)之間的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】進(jìn)一步闡明油梨植物、AM 真菌和土壤養(yǎng)分三者之間的關(guān)系，篩選AM真菌優(yōu)勢(shì)種，充分利用AM 真菌資源進(jìn)行油梨果園的水肥管理、引種栽培，從而促進(jìn)油梨的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣時(shí)間于2018 年春季，土壤樣品采集地點(diǎn)位于我國油梨主產(chǎn)區(qū)（表1）：廣東?。◤V東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）、廣西壯族自治區(qū)（廣西崇左市扶綏縣山圩鎮(zhèn)山圩農(nóng)場(chǎng)）和云南?。ūＩ绞新￡枀^(qū)潞江鎮(zhèn)芒棒村，德宏州瑞麗市勐秀鄉(xiāng)戶瓦村，德宏州瑞麗市勐秀鄉(xiāng)勐秀村，德宏州瑞麗市云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱經(jīng)所瑞麗實(shí)驗(yàn)站）等地采集12 個(gè)土壤樣品。樣品采集：在每一個(gè)采樣地采用隨機(jī)取樣法，選取5 株油梨樹，在滴水線范圍，剝離土壤表層枯葉、雜草、碎石，利用取土器收集0～20 cm 土樣，其中每株樹沿滴水線均勻采集5 份土壤，共計(jì)1 kg，混合均勻，帶回實(shí)驗(yàn)室。將所有土壤樣品均勻鋪在報(bào)紙上，去除大顆粒碎石、雜質(zhì)，置于室溫下通風(fēng)干燥2 周，待測(cè)。

表1 油梨根際土壤樣品來源Table 1 Source of avocado rhizosphere soil samples

1.2 AM 真菌孢子分離與鑒定

采用濕篩傾析-蔗糖離心法分離油梨根際土壤中AM 真菌孢子[14]，在體式顯微鏡下計(jì)數(shù)。用移液槍吸取單個(gè)孢子于載玻片上，采用水、PVLG、乳酸等做浮載劑，顯微鏡下觀察孢子顏色，連孢菌絲特征，并測(cè)量孢子大小。微用力壓破孢子觀察孢壁層次，厚度，顏色以及內(nèi)含物，輔助鑒定使用Melzer’s 試劑，觀察是否變色及變色情況，拍照記錄。

參照Schenck 等[15]的《VA 菌根真菌鑒定手冊(cè)》，劉潤進(jìn)等[16]的《菌根學(xué)》以及國際AM 真菌孢子鑒定網(wǎng)站INVAM（http://invam.caf.wvu.edu,edu/Myc-Info/）的分類描述及近年來發(fā)表的新種進(jìn)行（屬）種的檢索及鑒定。

1.3 AM 真菌多樣性指標(biāo)

孢子密度（spore density, SD）=每100 g 風(fēng)干原始土樣中總AM 真菌孢子數(shù)。

種的豐度（species richness, S）=油梨根際每100 g土壤中AM 真菌種的數(shù)目。

分離頻度（frequency, F）=（AM 真菌某種或?qū)俚臉臃綌?shù)/總樣方數(shù)）×100%。

相對(duì)多度（relative abundance, RA）=（AM 真菌某種或?qū)俚逆咦訑?shù)/AM 真菌總孢子數(shù)）×100%。

重要值（importance, I）=采用樣點(diǎn)或環(huán)境中AM真菌的屬（種）的分離頻度、相對(duì)多度的平均值（重要值），即I=（F+RA）/2。優(yōu)勢(shì)屬、種劃分：根據(jù)結(jié)果將AM 真菌劃分為4 個(gè)優(yōu)勢(shì)度等級(jí)，I≥50%為優(yōu)勢(shì)屬、種；I≥30%～50%為常見屬、種；I≥10%～30%為較常見屬、種；I＜10%為稀有屬、種。

Shannon-Weiner 物種多樣性指數(shù)（H）：假設(shè)1個(gè)包含N 個(gè)體的隨機(jī)樣本，其種i 的個(gè)體數(shù)為Ni，則Pi=Ni/N。因此H 可以表示為：

式中：k 為樣點(diǎn)中AM 真菌的種數(shù)；Pi為樣點(diǎn)AM真菌種的孢子密度占該樣點(diǎn)總孢子密度的百分比；

物種均勻度（J）= H/lnS；S 為樣點(diǎn)AM 真菌的種類數(shù)目。

1.4 油梨根際AM 真菌群落相似性系數(shù)測(cè)定

按Sorenson 系數(shù)公式計(jì)算不同樣地油梨根際AM 真菌群落組成相似性系數(shù)：Cs = 2j/（a +b）；j 為2 個(gè)樣地共同存在的油梨根際AM 真菌的種數(shù)目；a 為某樣地油梨根際的AM 真菌種數(shù)目，b 為另一樣地油梨根際的AM 真菌種數(shù)目。將AM 真菌群落物種相似度劃分為：極高（0.80～1.00）、高（0.61～0.80）、中（0.41～0.60）、低（0.21～0.40）、極低（＜0.20）。

1.5 油梨根系土壤理化性質(zhì)分析

參照鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》[17]，采用電位法測(cè)定土壤pH 值，重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測(cè)定有機(jī)質(zhì)，NH4F-HCl 浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷，堿性擴(kuò)散法測(cè)定有效氮，參照楊俐萍等[18]方法，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定有效鉀。采樣地根際土壤因子分析如表2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS25.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、多因素方差分析、相關(guān)性分析。

表2 油梨根際土壤因子分析Table 2 Analysis on factors of avocado rhizosphere soil

2 結(jié)果與分析

2.1 油梨根際土壤AM 真菌多樣性

2.1.1 根際土壤AM 真菌種質(zhì)資源與分布 本試驗(yàn)以廣東、廣西、云南主產(chǎn)區(qū)7 個(gè)樣地土壤中共分離AM 真菌3 屬33 種，其中球囊霉屬（Glomus）種類最豐富，共22 種，占總種數(shù)的65%；無梗囊霉屬（Acaulospora）7 種，占總種數(shù)的21%；盾巨孢囊霉屬（Scutellospra）4 種，占總種數(shù)的14%（表3）。3 屬在7 樣地中均有分布，球囊霉屬種數(shù)在各樣地分布頻度為50%～69%，無梗囊霉屬為15%～25%，盾巨孢囊霉屬為12%～25%，說明油梨根際AM 真菌種質(zhì)資源豐富，其中，球囊霉屬分布頻度遠(yuǎn)高于其他屬，為優(yōu)勢(shì)屬。

由表3、4 可知，木薯球囊霉、瑞氏無梗囊霉、深紅盾巨孢囊霉、黑色盾巨孢囊霉在所有樣地中均有分布，且I＞50%，為各地共有優(yōu)勢(shì)種（圖1）。近明球囊霉、疣突球囊霉在SY1 以外的樣地均有分布；疣狀無梗囊霉在SY2 以外樣地均有分布；純黃球囊霉、網(wǎng)狀球囊霉、副冠球囊霉、細(xì)凹無梗囊霉在RL 以外樣地廣泛存在；疣壁盾巨孢囊霉在GD 以外樣地均有分布。幼套球囊霉、金黃球囊霉、兩型球囊霉、布氏球囊霉在MX、GD 以外樣地均有分布，異型球囊霉在SY1、GD 以外樣地均有分布，沙荒球囊霉、異配盾巨孢囊霉在SY1、RL 以外樣地均有分布。重要值I 介于30%～50%為常見種，包括：白色球囊霉、純黃球囊霉、幼套球囊霉、近明球囊霉、沙荒球囊霉、金黃球囊霉、兩型球囊霉、網(wǎng)狀球囊霉、異性球囊霉、布氏球囊霉、副冠球囊霉、疣突球囊霉、疣狀無梗囊霉、細(xì)凹無梗囊霉、疣壁盾巨孢囊霉及異配盾巨孢囊霉。懸鉤子球囊霉為HW 的特有種。從油梨根際AM 真菌分離出較多的共有優(yōu)勢(shì)種與常見種，說明這些AM 真菌可以適應(yīng)油梨的種植環(huán)境，推測(cè)其可以與油梨建立良好的共生關(guān)系，而常見種沒有出現(xiàn)在所有樣地中，可能是因?yàn)檫@些種對(duì)某些土壤因子或氣候因子敏感。

2.1.2 油梨根際AM 真菌多樣性 不同樣區(qū)油梨AM 真菌種類與多樣性指數(shù)均存在較大差異（表5），其中MB 樣區(qū)種豐度最高，共分離出31 種孢子，占總種數(shù)的94%，孢子密度最高，共1 749 cfu·100 g-1，同時(shí)Shannon-Wiener 指數(shù)最高，達(dá)3.22；RL 樣區(qū)的孢子密度、種豐度及Shannon-Wiener 指數(shù)最低，說明RL 地區(qū)AM 真菌物種多樣性低；HW 與GD 種豐度很高，共分離出29 種與25 種孢子，但是孢子密度低，說明AM 真菌分布地區(qū)種豐度與孢子密度沒有直接相關(guān)性。

表3 油梨根際AM 真菌種質(zhì)資源與分布情況Table 3 Germplasms and distribution of AM fungi in avocado rhizosphere soil

表4 油梨根際AM 真菌相對(duì)豐度、分離頻度、重要值Table 4 Relative richness, isolation frequency, and importance of AM fungi in avocado rhizosphere soil

2.1.3 油梨根際AM 真菌相似性分析 由表6 可知，不同采樣地油梨根際AM 真菌組成的相似性系數(shù)為0.29～0.92，其中MB 與HW、SY2、GD，以及HW與SY2、GD 之間相似性系數(shù)極高且較為接近，為0.85～0.92。SY1 與SY2、MB、HW，SY2 與MX、RL、GD，MB 與MX，MX 與HW、RL、GD 之間相似性系數(shù)水平高，為0.62～0.78。7 個(gè)采樣地之間相似性系數(shù)普遍高或者極高，其中MB 與其他樣地相似性普遍較高，說明MB 樣地油梨根際的AM 真菌種類具有代表性。SY1 樣地與GD、MX 相似性系數(shù)水平低，分別為0.29 與0.36，而這3 地油梨同為“哈斯”品種，且不同品種的油梨反而出現(xiàn)相似性水平高的現(xiàn)象，說明品種可能不是影響油梨根際AM 真菌的主要因素，更可能與其他因子相關(guān)。

2.2 油梨根際AM 真菌多樣性與土壤養(yǎng)分相關(guān)性

對(duì)油梨根際AM 真菌多樣性與土壤養(yǎng)分因子進(jìn)行相關(guān)性分析（表7）。結(jié)果表明種豐度及多樣性指數(shù)與速效磷成極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），說明油梨AM 真菌多樣性受土壤速效磷含量的影響大，而與其他因素?zé)o顯著影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 油梨根際AM 真菌多樣性

本研究發(fā)現(xiàn)油梨根際AM 真菌豐富，7 個(gè)樣地中共分離出AM 真菌3 屬33 種，其中球囊霉菌是優(yōu)勢(shì)屬，其次是無梗囊霉屬。這與張美慶等[19]發(fā)現(xiàn)球囊霉屬為廣譜生態(tài)型，其次為無梗囊霉屬的結(jié)論相一致。球囊霉屬真菌與植物根系共生形成泡囊儲(chǔ)存脂類物質(zhì)，擴(kuò)大了菌絲的侵染途徑，從而能夠廣泛適應(yīng)于各種生境[20]。向丹等[9]認(rèn)為AM 真菌分布受土壤因子、地理因子、氣候因子及宿主植物及人為干擾的影響，其中土壤因子是最主要的影響因素。樣地間AM 真菌多樣性存在差異，但差異不大。郭紹霞等[21]發(fā)現(xiàn)，不同品種牡丹影響AM 真菌多樣性及群落組成。而在本研究中，種植不同油梨品種“哈斯”、“福瑞特”、“緬甸品種1”、“緬甸品種2”的土壤AM 真菌之間相似性大多高或極高，這是因?yàn)橛屠骐m然是高度雜交作物，但其遺傳變異率并不高[12]。因此不同品種油梨對(duì)AM 真菌的影響并不大。而種植同一“哈斯”品種的樣區(qū)反而存在土壤AM 真菌相似性低的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)橛屠娣N植區(qū)允許其他矮小的草本植物覆蓋土表，宿主多樣性會(huì)影響AM 真菌的多樣性。但更可能的因素是各地土壤養(yǎng)分差異大，造成真菌多樣性的差異。決定AM 真菌多樣性的并不是單一的因素，而是各生態(tài)因子作為整體綜合發(fā)揮作用的結(jié)果[21]。MB 與其他樣地相似性普遍高，說明MB 樣地最能代表7 個(gè)樣地油梨根際的AM真菌種類。

表5 不同試驗(yàn)區(qū)AM 真菌孢子密度、種豐度、多樣性指數(shù)Table 5 Spore density, species richness, and diversity index of AM fungi at different sites

表7 油梨根際AM 真菌多樣性與土壤因子相關(guān)性分析Table 7 Correlation between AM fungal diversity and rhizosphere fertility

接種AM 真菌Rhizoglomusfasciculatum 可有效提高油梨對(duì)P 的吸收以及地上部的生長[13]。說明AM真菌可與油梨形成共生結(jié)構(gòu)，促進(jìn)油梨生長發(fā)育。陳保東等[22]認(rèn)為接種土著AM 真菌，由于長期適應(yīng)環(huán)境，更容易與植株根系形成共生結(jié)構(gòu)，而接種其他AM 真菌，可能要面臨與當(dāng)?shù)卣婢鷱?qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致接種失敗。因此油梨專用菌肥可從油梨根際土壤分離的AM 真菌中篩選，更容易得到好的效果。此外，研究已發(fā)現(xiàn)蜜色無梗囊霉、聚叢球囊霉、幼套球囊霉及摩西球囊霉可以顯著促進(jìn)多種植物，如藍(lán)莓、構(gòu)樹等吸收P 元素，促進(jìn)植株生長，并提高根際酶活性，改善根際微環(huán)境[23、24]。推測(cè)這些AM 真菌對(duì)于廣泛適應(yīng)于多種植物根系，推測(cè)接種油梨根系時(shí)，對(duì)油梨生長也會(huì)有很好的促生效果。為篩選專用菌肥提供參照。

3.2 AM 真菌與土壤因子關(guān)系

本研究表明，AM 真菌種豐度及多樣性指數(shù)與土壤P 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這與劉海躍等的研究結(jié)果一致。土壤高濃度的有效磷抑制叢枝菌根的生長發(fā)育，縮短菌絲分枝和總長度，這是由于磷濃度高時(shí)寄主植物根系分泌物成分發(fā)生變化導(dǎo)致的[25]。土壤內(nèi)的磷總量十分豐富，但大多被礦石等固定，不能為植物吸收。AM 真菌能夠分解土壤中難溶磷，轉(zhuǎn)化為宿主植物可吸收的養(yǎng)分，分泌并活化多種土壤酶類，降低pH，提高土壤養(yǎng)分含量，并通過菌根結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移給植物根系，同時(shí)擴(kuò)大宿主植物根系網(wǎng)絡(luò)，讓根系吸收更多的營養(yǎng)，同時(shí)疏松土壤，增加根系透氣性。AM 真菌與植物共生機(jī)制是“雙贏”的營養(yǎng)交換模式，AM 真菌為植物提供礦質(zhì)營養(yǎng)與養(yǎng)分，而植物為AM 真菌提供C 源保證真菌生長與繁殖。當(dāng)土壤N、P 缺乏時(shí)，植物受營養(yǎng)脅迫上調(diào)獨(dú)腳金內(nèi)酯的表達(dá)，刺激AM 真菌繁殖并侵染根系，以換取自身得到更多的土壤養(yǎng)分[26]。因此，適當(dāng)?shù)牧酌{迫，可以刺激更多AM 真菌與植株根系建立共生結(jié)構(gòu)。Elisa Bona 等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)油梨同時(shí)施用AM 真菌與解磷菌對(duì)油梨的生長量與吸收磷的效果比單獨(dú)施用AM 真菌或解磷菌的效果好[27]。在磷含量高的土壤區(qū)域接種AM 真菌，即使土壤內(nèi)天然AM 真菌含量高，也能夠顯著提高AM 真菌豐度并顯著提高作物生長量，并在一定程度上可以代替磷肥[28]。

劉潤進(jìn)等[29]認(rèn)為在一定范圍內(nèi)，有機(jī)質(zhì)含量越高，AM 真菌孢子密度與多樣性越高；而超過一定范圍，反而受抑制。本研究中，MB 樣地有機(jī)質(zhì)含量最高，其孢子密度、種豐度與多樣性指數(shù)也最高，其中孢子密度達(dá)1 749 cfu·g-1。而有機(jī)質(zhì)含量最低的RL樣地，各指數(shù)也最低，孢子密度僅109 cfu·g-1，但其余樣地沒有表現(xiàn)出這樣的相關(guān)性，可能是受其他養(yǎng)分因素的綜合影響大。如MX 樣地，有機(jī)質(zhì)與速效磷含量適中，但土壤AM 真菌孢子密度不高，可能的原因是，MX 樣地堿解氮含量高，硝態(tài)氮積累多，導(dǎo)致土壤pH 偏低（4.04），抑制AM 生存，同時(shí)樣地海拔較高，氣候較冷，不適于AM 真菌生長發(fā)育。

研究表明，使用化肥N、P 元素，與土壤內(nèi)AM真菌直接接觸會(huì)降低AM 真菌多樣性與活性，在油梨種植園區(qū)，應(yīng)減少使用無機(jī)肥料，以有機(jī)肥或緩釋肥代替無機(jī)肥，不造成土壤養(yǎng)分大起大落，為AM真菌定植與侵染油梨根系，提供相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境。從長遠(yuǎn)上看，建立AM 真菌穩(wěn)定的土壤生態(tài)環(huán)境，對(duì)于減少化肥與農(nóng)藥使用量有重要意義，可以降低生產(chǎn)成本，減輕農(nóng)戶負(fù)擔(dān)，使農(nóng)戶更樂于使用。