仙客來(lái)新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南的研制

鄧 姍，褚云霞，3*，林 艷，郭偉珍，楊旭紅，李壽國(guó)，陳海榮，3**

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測(cè)試（上海）分中心，上海201415；3上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201403；4河北省林業(yè)科學(xué)研究院，石家莊050061；5農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京100122）

仙客來(lái)（Cyclamen persicumMill.）為報(bào)春花科仙客來(lái)屬多年生球根草本花卉，其葉片心形或近心形，造型可愛；花色豐富，有白色，紫色，紅色及復(fù)色等，花瓣上有復(fù)輪、爪、眼睛狀斑塊等圖案，極具觀賞性；仙客來(lái)花期長(zhǎng)，開花時(shí)間為11月至翌年5月，恰逢圣誕、元旦、春節(jié)等重大節(jié)日，深受廣大消費(fèi)者的喜愛［1］。

18世紀(jì)中葉，英、法、德的園藝家開始了仙客來(lái)新品種的培育，20世紀(jì)仙客來(lái)已發(fā)展成國(guó)際性的重要盆花。日本、荷蘭、瑞典、美國(guó)、以色列和澳大利亞紛紛開展仙客來(lái)的育種。至今已培育出數(shù)千個(gè)園藝品種，并推廣到世界各地［2］。盡管仙客來(lái)品種眾多，但除保護(hù)所有種屬的國(guó)家外，僅中國(guó)和比利時(shí)將仙客來(lái)納入了保護(hù)名錄，除歐盟外，僅日本和韓國(guó)有申請(qǐng)量，申請(qǐng)量也較少，僅授權(quán)105件，因此國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）尚未開展國(guó)際DUS測(cè)試指南的研制。

中國(guó)沒有仙客來(lái)野生資源的天然分布，20世紀(jì)20—30年代開始引入仙客來(lái)進(jìn)行栽培［3］，目前市場(chǎng)上的主要栽培品種均為國(guó)外引進(jìn)的仙客來(lái) F1代雜交種［4］，主要來(lái)自莫萊爾公司（The Morel Diffusion company）、荷蘭先正達(dá)種子有限公司（Syngenta Seeds BV）、荷蘭斯好萊花卉公司（Schoneveld Breeding）、艾羅仙客來(lái)育種公司（Eyraud Plants）幾大國(guó)際知名育種公司。隨著育種和栽培技術(shù)的不斷提高和完善，仙客來(lái)的發(fā)展取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，早在20世紀(jì)70年代末，天津仙客來(lái)盆花在全國(guó)就有了一定知名度，現(xiàn)已建立160多個(gè)品種的仙客來(lái)種質(zhì)基地［5］。近年來(lái)，我國(guó)仙客來(lái)的生產(chǎn)和銷售更是呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)［5］，在各大省市的銷售排名均在前十位。目前在山東、河北、遼寧、四川、山西、云南、內(nèi)蒙古、上海、北京等地均建立了仙客來(lái)生產(chǎn)基地，2018年仙客來(lái)每盆售價(jià)在60元（人民幣，下同）到150元不等，每年都有一定數(shù)量仙客來(lái)盆花出口日本。我國(guó)仙客來(lái)育種工作也取得了一定成績(jī)，如天津市園林綠化研究所通過自交和雜交的方法推出七大系列40多個(gè)類型的仙客來(lái)新型材料［6］、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所的銀葉系列新品種［7］、山東萊州育成的新潮系列、長(zhǎng)袍系列和大酒瓶系列、萊州大紅等［8］。同時(shí)在突變育種［9］、單倍體育種［10］方面也進(jìn)行了一定的研究。

DUS（特異性、一致性和穩(wěn)定性）是品種的基本屬性，植物品種具備DUS三性是獲得植物品種權(quán)的必要條件［11］。為了規(guī)范市場(chǎng)，保護(hù)育種者權(quán)利，促進(jìn)更多更好國(guó)外品種引入我國(guó)市場(chǎng)及我國(guó)新優(yōu)品種走出國(guó)門，進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，均需實(shí)行新品種保護(hù)。具有相應(yīng)種（屬）的測(cè)試指南是開展DUS測(cè)試的必備條件之一。本研究闡述仙客來(lái)DUS測(cè)試指南研制的主要過程和制訂的主要方式，列出所有數(shù)量性狀的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以期較好地指導(dǎo)仙客來(lái)DUS測(cè)試實(shí)踐。

1 研制的目標(biāo)和過程

1.1 研制目標(biāo)

仙客來(lái)DUS測(cè)試指南的研制以《中華人民共和國(guó)植物新品種保護(hù)條例》為準(zhǔn)則，以《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南總則》（GB/T 19557.1—2004）［12］、《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查和性狀統(tǒng)一描述總則》［13］和《植物新品種測(cè)試指南的研制》（UPOV TGP/7/4）［14］等文件為指導(dǎo)，結(jié)合我國(guó)仙客來(lái)育種和生產(chǎn)的現(xiàn)狀，研制出符合我國(guó)國(guó)情的仙客來(lái)DUS測(cè)試指南。

1.2 研制過程

1.2.1 參考資料的收集

收集日本測(cè)試指南以及與仙客來(lái)相關(guān)的育種、資源等20余篇文獻(xiàn)以及《中國(guó)植物志》等資料。

1.2.2 仙客來(lái)資源收集與栽培

共收集28份仙客來(lái)品種，種植于農(nóng)業(yè)部植物新品種測(cè)試（上海）分中心玻璃溫室中，按植物大小不同分別種植于12—15 cm花盆，以泥炭∶珍珠巖（3∶1）混合為栽培基質(zhì)，單株盆栽。

1.2.3 仙客來(lái)DUS測(cè)試指南研制的主要內(nèi)容的確定

（1）依據(jù)相關(guān)資料對(duì)仙客來(lái)的抗病性，抗逆性等特性進(jìn)行預(yù)判；

（2）依據(jù)《中國(guó)植物志》及日本的測(cè)試指南，初步確定候選性狀；

（3）通過田間試驗(yàn)，篩選性狀，對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行分級(jí)，并依據(jù)此數(shù)據(jù)確定標(biāo)準(zhǔn)品種；

（4）結(jié)合田間試驗(yàn)和室內(nèi)分析試驗(yàn)，研究仙客來(lái)DUS三性的測(cè)試方法，包括樣本數(shù)量、測(cè)試時(shí)期、測(cè)試部位以及觀察方法；

（5）確定分組性狀，編寫技術(shù)問卷。

2 仙客來(lái)DUS測(cè)試指南的制訂

按照農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心撰寫的《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南編寫規(guī)則》，仙客來(lái)DUS測(cè)試指南由10個(gè)章節(jié)和3個(gè)規(guī)范性附錄組成（表1）。

表1 仙客來(lái)新品種DUS測(cè)試指南的結(jié)構(gòu)Table 1 The structure of guidelines for the conduct of tests for distinctness，uniform ity and stability：Cyclamen

2.1 適用對(duì)象的確定

仙客來(lái)屬（Cyclamen）約20個(gè)種［15］。其中仙客來(lái)（C.persicum）是本屬最著名、栽培最廣泛的植物，于20世紀(jì)30年代就引入我國(guó)栽培?，F(xiàn)在的仙客來(lái)品種大部分是從原種仙客來(lái)經(jīng)過多年培育改良而來(lái)，該原種有兩個(gè)變種，即大花形變種（var.giganteumHort）和暗紅色變種（var.spendensHort）［16］。國(guó)際上申請(qǐng)品種權(quán)也主要集中在地中海仙客來(lái)（C.hederifoliumAiton）、仙客來(lái)（C.persicumMill.）、仙客來(lái)與歐洲仙客來(lái)雜交種（C.persicumMill.×C.purpurascensMill.）、歐洲仙客來(lái)（C.purpurascensMill.）。已有的形態(tài)學(xué)［17］、細(xì)胞學(xué)［18］、分子生物學(xué)［19］研究均表明，三種仙客來(lái)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，特別是仙客來(lái)與其他兩種均有顯著差別。其中歐洲仙客來(lái)和地中海仙客來(lái)染色體數(shù)目均為34，花期夏秋季，而仙客來(lái)為48，花期冬春季。三種仙客來(lái)形態(tài)上有較大差別，如地中海仙客來(lái)根從塊莖的上部和側(cè)邊長(zhǎng)出，葉心形到箭形，由于具較強(qiáng)耐寒性，多用于庭院種植；歐洲仙客來(lái)根從塊莖的側(cè)邊和底部長(zhǎng)出，葉腎形到心形，冬季不落葉，花香；而仙客來(lái)一般從底部長(zhǎng)出，葉心形到近圓形。由于目前我國(guó)市場(chǎng)上收集到品種均為仙客來(lái)，因此規(guī)定本指南僅適用于仙客來(lái)（C.persicumMill.）新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試和結(jié)果判定，仙客來(lái)屬的其他種可參考。

2.2 測(cè)試性狀的選擇與確定

日本仙客來(lái)測(cè)試指南包括了42個(gè)性狀，其中41個(gè)形態(tài)性狀，1個(gè)物候期性狀，有些性狀極為繁瑣，如花瓣顏色需分先端、中部、基部分別進(jìn)行比色，有些性狀難以觀測(cè)，例如花莖結(jié)實(shí)后的螺旋程度等。因此結(jié)合國(guó)內(nèi)科研、生產(chǎn)等實(shí)際情況，以及多年來(lái)田間觀測(cè)，最終確定了該標(biāo)準(zhǔn)中的40個(gè)性狀（表2）。

表2 仙客來(lái)DUS測(cè)試指南性狀Table 2 The characteristics in DUS test guidelines of C.persicum

（續(xù)表2）

注：QN：數(shù)量性狀 QL：質(zhì)量性狀 PQ：假質(zhì)量性狀VG：群體目測(cè) MS：個(gè)體測(cè)量；灰色是特別提示測(cè)試性狀的適用范圍

仙客來(lái)的葉和花均具有較高的觀賞性，因此大部分性狀集中在葉和花上，分別為15個(gè)和23個(gè)。按照性狀的表達(dá)類型進(jìn)行分類，質(zhì)量性狀8個(gè)，數(shù)量性狀20個(gè)，假質(zhì)量性狀12個(gè)（表3）。

表3 仙客來(lái)DUS測(cè)試指南選用的性狀分類Table 3 The type of characteristics in DUS test guidelines of C.persicum 個(gè)

日本測(cè)試指南適用范圍為仙客來(lái)屬［20］，其中較多性狀由于在其他種上表現(xiàn)出多態(tài)性，并不適合仙客來(lái)，因此我國(guó)指南刪除了15個(gè)性狀，增加了13個(gè)性狀（表4）。刪除的性狀中，“花瓣：邊緣缺刻數(shù)量”和“花瓣：邊緣缺刻程度”在實(shí)際的觀察中難于區(qū)分，增加了測(cè)試誤差，因此中國(guó)指南中在保留了“花瓣：邊緣缺刻”的性狀的同時(shí)，將表達(dá)狀態(tài)調(diào)整為無(wú)、弱、強(qiáng)三種；仙客來(lái)的花瓣次色不僅分布在邊緣及先端，也可能分布在縱向分布，而僅分別觀測(cè)花瓣先端、中部和基部顏色，不能區(qū)分主色和次色，無(wú)法對(duì)花瓣顏色進(jìn)行準(zhǔn)確描述，因此改為分別觀測(cè)花瓣的主色與次色，并觀測(cè)次色的類型和位置分布；日本指南中開花習(xí)性有春季開花、秋季開花、四季開花三種表達(dá)狀態(tài)，而仙客來(lái)花期受溫度、水分、光照以及施肥的因素影響較大且可長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，另外由于仙客來(lái)屬于日照中性植物，日照長(zhǎng)度的變化對(duì)花芽分化和開花沒有決定性的作用［21］。其花期主要受生長(zhǎng)狀態(tài)影響，一般播種后12—15個(gè)月開花，因此刪除了該性狀。

表4 仙客來(lái)DUS測(cè)試指南中日版對(duì)比Table 4 Difference between DUS test guidelines of China and Japan

在收集到的品種中未觀測(cè)到花萼瓣化現(xiàn)象，反而有雄蕊發(fā)生瓣化（圖1），而雄蕊瓣化到一定程度后可能成為重瓣品種，因此，在未計(jì)數(shù)花瓣數(shù)的情況下，有必要觀測(cè)雄蕊的瓣化情況。

圖1 花：雄蕊的瓣化Fig.1 Flower：petalody of stamen

一般情況下仙客來(lái)的萼片數(shù)為5片，觀測(cè)中發(fā)現(xiàn)有數(shù)量增減情況，大多數(shù)情況下，萼片數(shù)與花瓣數(shù)相同，如4花瓣和4萼片，6花瓣和6萼片，也有可能不同，如同樣為6萼片，則存在5花瓣和7花瓣的情況，由于這種變異在品種中并不完全一致，因此僅觀測(cè)萼片是否出現(xiàn)變異，而并不計(jì)數(shù)萼片的數(shù)目（圖2）。

圖2 花：萼片變異Fig.2 Flower：variation of sepal number

花藥顏色有黃色、褐色和紫紅色，塊莖顏色分別為淺褐色、灰褐色和紅褐色，這兩個(gè)性狀觀測(cè)方便，受環(huán)境影響小，滿足DUS測(cè)試性狀的其他要求，因此增加為測(cè)試性狀。

對(duì)于仙客來(lái)來(lái)說(shuō)，花是重要的觀賞部位，花莖的數(shù)量是評(píng)價(jià)仙客來(lái)盆花商品價(jià)值的重要指標(biāo)，而且隨著仙客來(lái)作為切花應(yīng)用，花莖數(shù)量多必將成為育種的主要目標(biāo)。盡管花葉的數(shù)量具有明顯的相關(guān)性，但Neuray［22］認(rèn)為莖的表面可以直接形成不定芽，不定芽可以分化葉芽和花芽，因此，花葉的數(shù)量并不呈現(xiàn)一對(duì)一的相關(guān)性。因此，有必要增加花莖：數(shù)量作為測(cè)試性狀。

2.3 數(shù)量性狀分級(jí)

依據(jù)《植物新品種特異性、一致性及穩(wěn)定性測(cè)試及統(tǒng)一描述總則》（TG/1/3）的說(shuō)明，參照朱頂紅新品種DUS測(cè)試數(shù)量性狀的分級(jí)方法［23］，結(jié)合田間試驗(yàn)，對(duì)仙客來(lái)的9個(gè)需進(jìn)行個(gè)體測(cè)量的數(shù)量性狀進(jìn)行分析，9個(gè)數(shù)量性狀的最小值、最大值、平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)等值見表5?？梢钥闯?，這些品種的平均變異系數(shù)分布在8.3%—17.7%，除葉片數(shù)量和葉柄長(zhǎng)度外，其他性狀的變異系數(shù)均小于15%，表明這些性狀在品種內(nèi)表達(dá)滿足一致性要求。按照級(jí)差大于等于2倍平均標(biāo)準(zhǔn)差的要求，將9個(gè)性狀進(jìn)行分級(jí)（表6）。

表5 仙客來(lái)DUS測(cè)試數(shù)量性狀Table 5 The data of quantitative characteristics used for DUS testing of C.persicum

表6 仙客來(lái)DUS測(cè)試數(shù)量性狀的分級(jí)Table 6 The scales of quantitative characteristics used for DUS testing of C.persicum

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品種的選用

在植物新品種測(cè)試中，用于性狀示例、校準(zhǔn)環(huán)境對(duì)性狀的影響的品種，稱為標(biāo)準(zhǔn)品種。標(biāo)準(zhǔn)品種的選用原則是容易獲得且性狀表達(dá)穩(wěn)定，盡可能用最少量的標(biāo)準(zhǔn)品種涵蓋所有性狀及其表達(dá)狀態(tài)［24］。本指南中采用了大量的圖片及圖例進(jìn)行性狀解釋，而僅選用了4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種：日本模瓣粉、艾羅紅皺邊、清芬大花紅、荷蘭小花白，分別使用了15次、6次、31次和13次，為9個(gè)數(shù)量性狀的年度間及地點(diǎn)間的校準(zhǔn)提供依據(jù)，大大減少了測(cè)試工作量、降低了測(cè)試成本。

2.5 分組性狀的選用

按照TGP/7/2的說(shuō)明，分組性狀必須是質(zhì)量性狀或者在不同地點(diǎn)的表達(dá)狀態(tài)能夠明顯區(qū)分已知品種的數(shù)量性狀或假質(zhì)量性狀；能夠排除已知品種或者在進(jìn)行DUS測(cè)試時(shí)能夠安排近似品種相鄰種植［25］。分組性狀的數(shù)量不是固定的，如果只有少數(shù)性狀滿足以上的標(biāo)準(zhǔn)，則它們可能全部被選為分組性狀；如果滿足上述條件的性狀較多，則選擇部分為分組性狀。

依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，仙客來(lái)測(cè)試指南選用了6個(gè)分組性狀，分別是（1）植株：大?。ㄐ誀?）；（2）花莖：數(shù)量（性狀 16）；（3）花瓣：邊緣波狀程度（性狀 25）；（4）花瓣：長(zhǎng)度（性狀 26）；（5）花瓣：主色（性狀 30）；（6）花：雄蕊的瓣化（性狀35）。

2.6 仙客來(lái)DUS判定標(biāo)準(zhǔn)

2.6.1 特異性判定

特異性是如果一個(gè)品種明顯區(qū)別于申請(qǐng)時(shí)其他任何已知品種，則認(rèn)為該品種具有特異性。在測(cè)試中，當(dāng)申請(qǐng)品種至少在一個(gè)性狀上與近似品種具有明顯且可重現(xiàn)的差異時(shí)，即可判定申請(qǐng)品種具備特異性。

2.6.2 一致性判定

如果一個(gè)品種“考慮到其有性繁殖或無(wú)性繁殖表現(xiàn)出足夠的同質(zhì)性”，則認(rèn)為其具備一致性。

種子繁殖是仙客來(lái)的主要繁殖方式，而雜交育種是仙客來(lái)的主要育種方式，因此在DUS測(cè)試中，一致性判定時(shí)，允許相對(duì)較多的異型株，采用了2%的群體標(biāo)準(zhǔn)和至少95%的接受概率。當(dāng)樣本大小為19—41株時(shí)，最多可以允許有2個(gè)異型株，當(dāng)樣本大小為42—60株時(shí)，最多可以允許有3個(gè)異型株。而葉片斑紋由于受光照、營(yíng)養(yǎng)等因素影響較大，在一致性判定時(shí)，品種的變異程度不能顯著超過同類型品種。

2.6.3 穩(wěn)定性判定

如果一個(gè)品種經(jīng)過重復(fù)繁殖后，或在每個(gè)特定的繁殖周期結(jié)束時(shí)，如果其相關(guān)性狀仍保持不變，則應(yīng)認(rèn)為其具備穩(wěn)定性。一般情況下，不對(duì)穩(wěn)定性做測(cè)試，當(dāng)遞交的材料具有一致性，則認(rèn)為具有穩(wěn)定性。必要時(shí)，可以種植該品種的下一批種子，與以前提供的種子相比，若性狀表達(dá)無(wú)明顯變化，則可判定該品種具備穩(wěn)定性。對(duì)于雜交種的穩(wěn)定性判定，還可以通過測(cè)試其親本的一致性和穩(wěn)定性來(lái)進(jìn)行判定。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)仙客來(lái)DUS測(cè)試指南在調(diào)查市場(chǎng)上主栽品種的基礎(chǔ)上，充分考慮我國(guó)的育種現(xiàn)狀，選擇了40個(gè)表達(dá)穩(wěn)定、多態(tài)性好且易于觀察的性狀作為DUS測(cè)試性狀。其中20個(gè)QN性狀僅有8個(gè)性狀需個(gè)體測(cè)量，在減少測(cè)試工作量的同時(shí)保證了性狀的區(qū)分能力。仙客來(lái)品種分類至今沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，多以花型分類，分為皇冠型、平瓣型、洛可可型、大花型四種［26］。分組性狀綜合考慮了生產(chǎn)上常用的分組方式，依據(jù)花瓣長(zhǎng)度可以先將大花型品種、皇冠型品種與平瓣型和洛可可型分成兩組，再根據(jù)花瓣：邊緣波狀程度將大花型品種與皇冠型品種區(qū)別開。同時(shí)通過植株：大小區(qū)分巨型品種、中型品種及微型品種。

對(duì)于數(shù)量性狀，根據(jù)品種內(nèi)的變異程度、品種間差異程度、育種水平、品種的繁殖方式等不同可采用目測(cè)或測(cè)量的方式。個(gè)體測(cè)量可以取得較多的信息，在一致性和特異性分析時(shí)不僅可以采用代碼法，還能用統(tǒng)計(jì)分析方法，但同時(shí)也將耗費(fèi)較多的時(shí)間采集數(shù)據(jù)。有些數(shù)量性狀如“花莖：粗度”，經(jīng)分析其品種內(nèi)變異系數(shù)僅8.3%，且只分3級(jí)，級(jí)差較大，在測(cè)試任務(wù)量大的情況下，可以考慮采用群體測(cè)量或群體目測(cè)的方式，以提高測(cè)試效率。

盡管在仙客來(lái)品種內(nèi)存在個(gè)別花朵萼片與花瓣數(shù)不為5的情況，但在“花：花瓣數(shù)”的觀測(cè)時(shí)，以占多數(shù)的花瓣數(shù)為整個(gè)品種該性狀的表達(dá)狀態(tài)，因此所有收集到的品種都只有一種表達(dá)狀態(tài)，該性狀不能區(qū)分品種的特異性，不滿足作為DUS測(cè)試的要求，因此刪除了這個(gè)性狀。而許多文獻(xiàn)（如《中國(guó)植物志》［27］）均表示仙客來(lái)有重瓣品種，且有報(bào)道日本已成功育成了重瓣系仙客來(lái)。雖然在我國(guó)市場(chǎng)上還未見到重瓣品種，但是隨著育種的進(jìn)程，未來(lái)有可能出現(xiàn)半重瓣和重瓣品種，為了提高指南的適用性，當(dāng)該類型品種大量出現(xiàn)時(shí)，應(yīng)對(duì)指南進(jìn)行修改，增加“花：類型”或“花：花瓣數(shù)”為測(cè)試性狀。

我國(guó)仙客來(lái)DUS測(cè)試指南的研制過程中參考了日本仙客來(lái)屬DUS測(cè)試指南，刪除了在仙客來(lái)品種中缺乏多態(tài)性的性狀，同時(shí)增加了利于區(qū)分品種的性狀，提高了我國(guó)指南的適用性和可操作性。但是，早在2009年河北省林業(yè)科學(xué)研究院為培育適合我國(guó)栽培的地中海仙客來(lái)，就從國(guó)際仙客來(lái)協(xié)會(huì)荷蘭分會(huì)先后引進(jìn)多種不同類型的地中海仙客來(lái)［4］。另外歐洲仙客來(lái)等大量的不為人們所熟知的種在歐洲市場(chǎng)上都早已被利用起來(lái)［28］，我國(guó)仙客來(lái)DUS測(cè)試指南是否能適用于仙客來(lái)屬其他種，或者經(jīng)過修訂后能否擴(kuò)大適用范圍至仙客來(lái)屬，還需收集其他原生種進(jìn)行觀測(cè)驗(yàn)證。