改良減少子宮血流灌注法建立子癇前期大鼠模型

黃文亭，曾子純，王冬菊，肖小敏

(暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院， 廣州 510632)

子癇前期(pre-eclampsia, PE)是妊娠期特有的多系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)以由全身血管內(nèi)皮系統(tǒng)廣泛損傷為主要病理基礎(chǔ)的高血壓、蛋白尿?yàn)橹鳎菍?dǎo)致圍產(chǎn)期母嬰死亡的主要產(chǎn)科并發(fā)癥之一[1]。為了研究妊娠高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制及探索診治方法，目前國(guó)內(nèi)外有多種方法可建立妊娠期高血壓模型。其中傳統(tǒng)的減少子宮血流灌注(reduced-uterine perfusion pressure, RUPP)手術(shù)建立PE模型，由于能較針對(duì)性地引起由于胎盤缺血缺氧導(dǎo)致的妊娠高血壓，接近臨床上 PE 的發(fā)生機(jī)制，加上未使用藥物建模，可減少建模藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，相比其他建模方式為多人選擇[2]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)RUPP手術(shù)建模方法進(jìn)行改良，比較了RUPP+灌水法與傳統(tǒng)RUPP法建立子癇前期模型的效果差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠39只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供【SCXK(粵)2013-0034】，體重(250 ± 20)g，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(粵)2017-0174】。每晚將雌鼠與性成熟雄性大鼠按雌雄比 2∶1～3∶1合籠過(guò)夜，次日取雌鼠陰道分泌物涂片后在顯微鏡下觀察，見(jiàn)精子者定為孕0 d，妊娠后常規(guī)喂養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查(受理號(hào)20150205001)。

1.2 方法

1.2.1 孕14 d

開(kāi)腹手術(shù)，同時(shí)觀察妊娠仔鼠數(shù)將已孕14 d的雌性大鼠隨機(jī)分為三組：(1)RUPP組16例：觀察并記錄孕仔數(shù)后實(shí)施RUPP手術(shù)，關(guān)腹后不給予任何干預(yù)。(2)RUPP+灌水組10例：實(shí)施RUPP手術(shù)后每日給予雙蒸水2 mL灌胃。(3)假手術(shù)組13例：開(kāi)腹暴露腹主動(dòng)脈及雙側(cè)卵巢動(dòng)脈，不鉗夾血管。觀察并記錄孕仔數(shù)后即關(guān)腹，關(guān)腹后不給予任何干預(yù)。

RUPP手術(shù)方法：孕14 d大鼠異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，3%戊巴比妥鈉按4 mL/kg腹腔注射麻醉，沿下腹正中線開(kāi)腹，暴露腹主動(dòng)脈下端、子宮及卵巢動(dòng)脈，于腹主動(dòng)脈下段近髂動(dòng)脈分叉起始處置銀夾1枚鉗夾血管，左右兩側(cè)子宮動(dòng)脈第一分叉前分別置銀夾1枚，該法可使子宮血流灌注減少到40%，胎盤處于缺血缺氧狀態(tài)，常規(guī)關(guān)腹[2]。

1.2.2 孕18～20 d

觀察血壓、尿蛋白及妊娠結(jié)局(1)血壓測(cè)量：于孕19 d當(dāng)天12:00前完成有創(chuàng)頸動(dòng)脈插管，晚間20:00-21:00及第二天8:00-9:00清醒狀態(tài)下測(cè)量有創(chuàng)動(dòng)脈血壓2次取平均值。(2)尿蛋白：于孕18 d放DXL-10不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)大鼠代謝籠，留取24 h尿液，測(cè)量24 h尿蛋白定量。(3)仔鼠狀態(tài)的判斷：孕20 d測(cè)壓結(jié)束后腹腔注射麻醉下行剖宮產(chǎn)，觀察記錄仔鼠死亡、畸形情況。成仔鼠為活產(chǎn)與死、畸胎仔總和。分別對(duì)活胎及死胎統(tǒng)一稱重，再除以其胎數(shù)取平均值。分別對(duì)活胎胎盤及死胎胎盤稱重，取其均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 孕鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生了孕鼠死亡及仔鼠全部吸收的情況，其中假手術(shù)組、RUPP組、RUPP+灌水組納入實(shí)驗(yàn)孕鼠總數(shù)分別為13例、16例、10例，死亡孕鼠分別為0例、2例、0例，胎仔全吸收孕鼠分別為0例、4例、1例。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，三組間死亡率及吸收率差異均無(wú)顯著性(P=0.785，P=0.110)，因此將死亡孕鼠及胎仔全吸收鼠剔出實(shí)驗(yàn)，納入后續(xù)研究孕鼠數(shù)量分別是：假手術(shù)組13例、RUPP組10例及RUPP+灌水組9例。

2.2 三組孕鼠建模效果比較

2.2.1 三組孕鼠孕19～20 d血壓比較

建模后孕鼠收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓均有不同程度上升，差異有顯著性(P<0.05)；其中RUPP+灌水組血壓上升明顯，三項(xiàng)指標(biāo)較其余兩組差異均有顯著性(P<0.05)；RUPP組舒張壓與假手術(shù)相比差異無(wú)顯著性(P=0.122)。(表1)

2.2.2 三組孕鼠孕18 d，24 h尿蛋白比較

假手術(shù)組18 d，24 h尿蛋白為(3.47±1.32)mg，RUPP組為(4.96±0.85)mg，RUPP+灌水組為(4.14±1.05)mg，三組差異有顯著性(P=0.013)，其中RUPP組與假手術(shù)組相比顯著增高，差異有顯著性(P<0.05)，RUPP+灌水組與RUPP組及假手術(shù)組組間比較差異均無(wú)顯著性(P=0.103，P=0.183)。

2.2.3 三組孕鼠孕14 d及孕20 d胎仔數(shù)比較

各組孕鼠其孕20 d活仔率、成仔(活仔與死畸胎數(shù)之和)率為非正態(tài)，故使用中位數(shù)(M)進(jìn)行檢驗(yàn)，多組檢驗(yàn)方法為 Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較使用Mann-Whitney檢驗(yàn)。如表2所示，造模前孕14 d時(shí)各組孕仔差異無(wú)顯著性(P>0.05)，手術(shù)后，三組孕20 d活仔率及成仔率差異有顯著性(P=0.000)；組間比較，假手術(shù)組孕20 d活仔率及成仔率明顯高于RUPP組及RUPP+灌水組，差異有顯著性(均P=0.000)，RUPP組與RUPP+灌水組間比較差異無(wú)顯著性(P=0.968，P=0.549)。

表1 三組孕鼠孕20 d血壓比較Table 1 Comparison of blood pressure of the pregnant rats on G20 day among the three groups ± s)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05。與與RUPP組相比，bP<0.05。

Note. Compared with the sham operation group，aP<0.05. Compared with the RUPP group，aP<0.05.

表2 三組孕鼠孕14 d孕仔數(shù)及孕20 d胎仔數(shù)比較Table 2 Comparison of the numbers of fetuses on G14 day and litters on G20 day among the three groups ± s)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05。

Note. Compared with the sham operation group，aP<0.05.

2.2.4 三組胎仔體重及胎盤濕重比較

三組間孕20 d活仔體重及胎盤濕重差異有顯著性，其中假手術(shù)組活仔體重明顯高于RUPP組及RUPP+灌水組，差異有顯著性(P<0.05)，而RUPP組及RUPP+灌水組間差異無(wú)顯著性(P=0.746)。RUPP+灌水組胎盤濕重明顯低于假手術(shù)組，差異有顯著性(P<0.05)，RUPP組與RUPP+灌水組差異無(wú)顯著性(P=0.080)。(表3)

3 討論

3.1 常見(jiàn)PE動(dòng)物模型建立方法

目前，子癇前期的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，比較公認(rèn)是與子宮胎盤缺血缺氧有關(guān)，另外也與水鈉代謝遺傳異常、神經(jīng)功能紊亂、各種血清因子釋放異常等相關(guān)。因此，目前常見(jiàn)的子癇前期動(dòng)物模型建立方法包括[3]：(1)手術(shù)鉗夾腹主動(dòng)脈或子宮動(dòng)脈，減少子宮血流灌注，造成子宮胎盤缺血缺氧[4-5]。此法可快速建立模型，且缺血部位明確，也避免了藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)本身的干擾。但造模成功率不穩(wěn)定，也無(wú)法體現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵噬不足、胎盤淺著床等特異性PE病理改變。(2)品系為BPH/5小鼠和Dahl鹽敏感性大鼠的子代重復(fù)交配，可在自然培育的情況下產(chǎn)生高血壓，具有一定遺傳性[6]。此法無(wú)人工干預(yù)，發(fā)生機(jī)制與人類相同，但飼養(yǎng)條件高，育種周期長(zhǎng)，遺傳性不穩(wěn)定、易變種，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期。(3)應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)因子誘導(dǎo)模型[7]，或攜帶人重組缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白的腺病毒[8]，誘導(dǎo)孕鼠特異性產(chǎn)生PE樣癥狀。但并未報(bào)道腎臟、胎盤等臟器的病變情況，且藥物本身對(duì)胎鼠有毒性作用，可能干擾PE重要指標(biāo)的準(zhǔn)確性。(4)通過(guò)低氧、驚嚇、生活環(huán)境擁擠等物理方法，持續(xù)刺激孕鼠，誘發(fā)PE癥狀[9-10]；但未報(bào)道胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵噬情況及腎臟小血管損傷程度。

表3 三組胎仔體重及胎盤濕重比較Table 3 Comparison of fetal weight and placental wet weight among the three ± s)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05。

Note. Compared with the sham operation group，aP<0.05.

3.2 RUPP改良手術(shù)造模法

本次實(shí)驗(yàn)PE造模的目的是用于后續(xù)藥物試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)初始設(shè)計(jì)對(duì)孕鼠進(jìn)行單純RUPP手術(shù)造模，因后續(xù)研究需要灌藥干預(yù)，因此另外設(shè)置了RUPP+灌水組作為空白對(duì)照，但實(shí)驗(yàn)的結(jié)果非常有趣，雖然單純RUPP組與RUPP+灌水組均能出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等PE臨床表現(xiàn)，但單純RUPP手術(shù)血壓增高并不穩(wěn)定，有時(shí)甚至不能出現(xiàn)高血壓，而RUPP+灌水組孕鼠則能穩(wěn)定表現(xiàn)出高血壓，且仔鼠FGR情況更明顯。因此，我們認(rèn)為這可以成為一種RUPP改良模型。分析其原因可能為：RUPP手術(shù)后，在子宮胎盤缺血模型基礎(chǔ)上，每天灌胃對(duì)孕鼠造成壓力，使孕鼠持續(xù)處于緊張狀態(tài)，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度刺激，去甲腎上腺素分泌增多，抗血管收縮因子分泌減少，所以能誘導(dǎo)出更明顯的妊娠高血壓癥狀，與 Takiuti等[9]及 Kanayama等[11]等研究相符合。

本研究另外一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，雖然RUPP+灌水組孕鼠血壓更高，但其24 h尿蛋白量并未見(jiàn)明顯增高，是否與灌水后增加了血容量從而改善腎臟血流量有關(guān)？尚需進(jìn)一步研究。但本研究顯示，雖然RUPP+灌水組24 h尿蛋白量增加不明顯，胎兒生長(zhǎng)受限卻更顯著，而且胎盤濕重更低，說(shuō)明灌水并不能改善子宮胎盤血流，RUPP手術(shù)機(jī)械性鉗夾血管降低子宮灌注是非常有效的。

多年來(lái)，傳統(tǒng)RUPP手術(shù)建立PE模型由于能較針對(duì)性地引起由于胎盤缺血缺氧導(dǎo)致的妊娠高血壓，接近臨床上PE的發(fā)生機(jī)制，加上未使用藥物建模，可減少建模藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，相比其他建模方式人數(shù)較多選擇，但其重復(fù)性受大鼠品系、遺傳背景、實(shí)驗(yàn)室條件等影響因素較多[2,5,12-13]。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，RUPP+灌水后能更穩(wěn)定地構(gòu)建PE模型，為子宮胎盤缺血妊娠高血壓造模提供了新思路。

3.3 不足之處

RUPP手術(shù)對(duì)孕鼠基本體質(zhì)及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求較高，且RUPP手術(shù)及頸動(dòng)脈插管兩次手術(shù)對(duì)孕鼠打擊大，兩次手術(shù)間隔時(shí)間短，孕鼠未完全恢復(fù)，令實(shí)驗(yàn)?zāi)甘髞G失率及胎仔吸收率較預(yù)期高。

臨床公認(rèn)的PE發(fā)病機(jī)制為：胎盤缺血缺氧，局部釋放多種胎盤因子入血，引起全身小血管痙攣導(dǎo)致多臟器損傷。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)孕鼠血壓、蛋白尿及胎仔情況等臨床表現(xiàn)進(jìn)行了研究，并未關(guān)注孕鼠血液中的炎癥介質(zhì)含量及子宮以外其他臟器受損情況，能否模擬出臨床公認(rèn)的PE發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。