靜脈注射針與自制PE-50管針頭用于大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓測定的比較

葉妙勇，趙凡，馬軻，張利棕，方明筍，壽旗揚，馬寅鋒，黃文杰，呂伯東,6*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053； 2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿男科，江蘇 南通 226001； 3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，杭州 310053； 4. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實驗室，杭州 310005； 5. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，杭州 310005； 6. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)泌尿男科研究所，杭州 310053)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是男性常見性功能障礙疾病之一，指男性患者難以持續(xù)性的達到或保持足夠的陰莖勃起以完成令人滿意的性表現(xiàn)[1]，當男性患者長期無法完成滿意的性生活，將會影響家庭的和睦，并對身心造成難以避免的傷害。隨著年齡的增長及眾多基礎(chǔ)疾病發(fā)生、發(fā)展將會損害勃起功能，二十世紀末期，全球超過1.52億男性患者罹患ED，預(yù)估在2025年，將會新增1.7億男性患者受到ED困擾[2]。

陰莖勃起受到神經(jīng)血管復(fù)雜的調(diào)控作用，根據(jù)各類型ED的病因，國內(nèi)外學(xué)者們構(gòu)建了常見的相關(guān)ED的動物模型(包括神經(jīng)源性ED、血管源性ED、內(nèi)分泌源性ED等)用于陰莖勃起功能的研究[3]。嚙齒類動物ED模型與兔、貓、狗及靈長類動物ED模型比較，具有易飼養(yǎng)、易操作、經(jīng)濟實惠等優(yōu)勢，是目前ED動物模型中首選的實驗動物。

陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernsal pressure，ICP)測定實驗是目前評估嚙齒類動物ED模型勃起功能生理指標的首選檢測方式[4-8]，其主要過程包括陰莖海綿體置管、電刺激海綿體神經(jīng)、生理信號經(jīng)換能器向電信號轉(zhuǎn)換等[9]。陰莖海綿體置管過程中，研究者主要采用自制聚乙烯(polyethylene，PE)管針和靜脈輸注針(venoclysis needle，VN)兩種材料，ICP經(jīng)上述材料傳遞到生理信號換能器進行生理信號的轉(zhuǎn)換。糖尿病患者日益增多并且半數(shù)以上男性糖尿病患者遭受到ED困擾[10]，因此本文采用糖尿病ED大鼠模型。目前尚無文獻比較兩種材料對ICP測量數(shù)據(jù)結(jié)果的影響進行比較，結(jié)合糖尿病ED大鼠模型對換能過程中的兩種材料進行比較，以討論其中哪種陰莖海綿體置管材料更適用于測定ICP。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

成年雄性SPF級SD大鼠36只，7～8周齡，體重(180 ± 200)g，購于由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供【SCXK(滬)2013-0016】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心【SYXK(浙)2013-0184】，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會通過(倫理審批號：2018-145)，室溫20℃左右。照明/黑暗為12 h/12 h恒溫環(huán)境下圈養(yǎng)，標準飼料，自由飲水，直至試驗的當天。所有涉及到實驗動物的使用與操作均遵循3R原則。

1.1.2 儀器和耗材

MP160型16通道生理記錄分析系統(tǒng)購于美國BIOPAC公司；Master-8可編程刺激器購于以色列AMPI；阿撲嗎啡(apomorphine，APO)購于美國APExBIO公司(批號：B6936)；生理鹽水購于山東齊魯制藥有限公司；Masson三色染色試劑盒購于南京建成科技有限公司(批號：D026-1-3)；聚乙烯PE50導(dǎo)管購于英國Smith Medical公司；25-G靜脈輸注針購于江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司。外科及顯微外科常規(guī)手術(shù)器械。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立

36 只正常SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機抽取其中16 只作為正常對照組(normal control group，NC)，其余20 只歸為糖尿病ED組(diabetes mellitus group，DM)，DM組大鼠腹腔注射硫脲佐菌素(streptozotocin, STZ)60 mg/kg溶液構(gòu)建糖尿病ED模型。8周后，連續(xù)3 d抽尾靜脈血檢測大鼠血糖，篩選出16只隨機血糖均超過16.7 mmol/L的大鼠行阿撲嗎啡(apomorphine，APO)實驗。APO實驗在ICP測定實驗前兩天進行，篩選DM模型大鼠，使用100 μg/kg APO(50 μg/mL)一次性注射施用大鼠皮下頸部區(qū)域。APO實驗時，觀察并記錄兩組大鼠的勃起次數(shù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2.2 ICP測定及海綿體神經(jīng)刺激

造模結(jié)束后，使用3%戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，麻醉后仰臥位固定動物于手術(shù)板。對大鼠行腹部正中切口，大小約5 cm，逐層剪開并分離腹部皮膚及肌肉，暴露腹腔后使用棉花簽進行逐層剝離前列腺組織和粘膜。盆神經(jīng)節(jié)(major pelvic ganglia，MPG)貼附于前列腺左、右側(cè)葉前外側(cè)表面，MPG發(fā)出的海綿體神經(jīng)(cavernous nerve，CN)血管束貼附前列腺向下走行經(jīng)尿道支配陰莖(圖1a、b)。眼科鑷分離CN后，取一小段PE-10管置于分離空隙處[11](圖1b、c)，定位CN并且便于后續(xù)電刺激。電刺激參數(shù)：5 V，15 Hz，5 ms，60 s，刺激持續(xù)時間1 min，每次刺激間隔5 min。

陰莖海綿體插管：陰莖皮膚行縱切口暴露陰莖頭部，分離皮膚與白膜，暴露雙側(cè)陰莖海綿體后，分別使用自制PE50管(10 mL注射器針頭折斷，前后兩端連接PE-50管)以及25-G靜脈輸注針刺入陰莖海綿體，針頭內(nèi)壓力經(jīng)過兩種材質(zhì)傳導(dǎo)后連入壓力換能器。

1.2.3 平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)測定

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)，取頸部正中切口，使用鑷子逐層鈍性分離開頸部肌肉，暴露出左側(cè)頸總動脈，眼科剪剪小口后置入PE-50管，并連接到壓力換能器記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 Masson三色染色

大鼠勃起功能測定實驗結(jié)束后，取大鼠陰莖組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片分為兩組，一組用于HE染色，另一組用于Masson染色。Masson染色前先用蒸餾水潤濕玻片30 s，核染液染色60 s，丟棄，沖洗液沖洗30 s。漿染液染色30 s，丟棄，沖洗液沖洗30 s。黃色分色液分色8 min左右棄去分色液，直接用藍色復(fù)染液染色5 min左右，丟棄，使用無水乙醇沖洗干凈，載玻片吹干后使用封片劑封片，顯微鏡下觀察。

1.2.5 阿撲嗎啡實驗

阿撲嗎啡評估勃起功能實驗參照Yang等[12]報道的方法，ICP測定實驗前2 d，大鼠喂食后置于環(huán)境安靜房間的觀察籠中，觀察房間的燈光亮度調(diào)暗至可以肉眼觀察的，等待10 min使大鼠適應(yīng)新環(huán)境。于大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡(100 μg/kg)，注射后30 min內(nèi)觀察并記錄陰莖勃起情況，陰莖末端出現(xiàn)充血的陰莖頭部記錄為一次勃起。正常組的大鼠與糖尿病模型組大鼠進行統(tǒng)計比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 陰莖海綿體內(nèi)壓檢測主要流程及海綿體神經(jīng)解剖位置

海綿體神經(jīng)分支向尿道方向走行(圖1a)，使用眼科鑷分離出海綿體神經(jīng)并套如PE-10管(圖1b、c)，分別用兩種置管材料進行插針(圖1d、e)，刺激海綿體神經(jīng)后可見壓力換能管內(nèi)有明顯血液回流(圖1f)。

注:a、b：海綿體神經(jīng)定位；c：PE-10分離海綿體神經(jīng)；e、f：陰莖海綿體置管。圖1 ICP檢測流程及海綿體神經(jīng)解剖位置Note. a, b，Localization of cavernous nerve. c， PE-10 separation of cavernous nerve. e, f， Pin insert into the cavernosum.Figure 1 Operation process of ICP detection and anatomical site of the cavernous nerve

注：紅色箭頭：平滑肌厚度。與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖2 Masson三色染色顯示大鼠陰莖海綿體組織中平滑肌和膠原纖維含量(n=5)Note. Red arrow: thickness of smooth muscle. Compared with the normal control group,*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001.Figure 2 Smooth muscle and collagen contents in the cavernous tissues of rat penises showed by Masson’s trichrome staining (n=5)

2.2 大鼠陰莖海綿體組織Masson三色染色

DM組與NC組大鼠陰莖海綿體組織Masson三色染色，DM組中海綿竇內(nèi)平滑肌厚度和含量明顯減少(圖2A：紅色箭頭)。此外，DM組中大鼠陰莖海綿體中膠原纖維含量顯著增加，纖維密度致密(圖2A)。如圖2B所示，DM組與NC組比較，平滑肌百分比面積明顯減少(P< 0.01)，膠原纖維百分比面積增加(P< 0.05)，平滑肌與膠原纖維百分比顯著減少(P< 0.001)。

2.3 阿撲嗎啡實驗

對DM組大鼠造模情況使用APO實驗進行驗證。兩組大鼠在注射APO后均出現(xiàn)打哈欠、躁動、骨盆前推、包皮后退和陰莖勃起等生理活動現(xiàn)象。結(jié)果顯示，DM組大鼠勃起次數(shù)與正常對照組相比具有顯著差異(P< 0.05)(圖3)。

2.4 大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓評估勃起功能

NC組與DM組使用海綿體內(nèi)壓插管記錄勃起功能相關(guān)數(shù)據(jù)，同NC組相比，DM組大鼠ICP/MAP與曲線下面積(AUC)具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.01)，表明大鼠糖尿病模型造模成功，與阿撲嗎啡實驗結(jié)果相一致。正常組大鼠使用PE與VN記錄的ICP/MAP與AUC差異無顯著性(P=0.1386，P=0.0692)。DM組ED大鼠使用PE與VN記錄的ICP/MAP與AUC差異無顯著性(P=0.1386，P=0.2121)(圖4)。

注：與正常組相比，***P< 0.001。.圖3 阿撲嗎啡實驗評估兩組大鼠勃起功能(n=8)Note. Compared with the normal control group,***P< 0.001.Figure 3 Apomorphine experiments are performed to evaluate the erectile function in the two groups (n=8)

表1 兩組大鼠中使用PE-50與VN記錄數(shù)據(jù)比較Table 1 Comparison of PE-50 and VN recorded data in the two groups of rats

注：和相應(yīng)分組里對照組比較，*P< 0.05,**P< 0.01。

Note.Compared with the control group in the same grouping,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

1863年Eckhardt首次在犬類動物模型中證實了盆神經(jīng)節(jié)支配勃起生理反應(yīng)，而1968年Lewist等首次對公牛進行陰莖海綿體測壓，結(jié)合上述的生理功能測試以及動物的生理解剖，繼而，更多的學(xué)者將實驗動物模型轉(zhuǎn)向嚙齒類動物[12-14]。主要是由于大鼠勃起生理反應(yīng)和人類具有許多相似性，并且大鼠飼養(yǎng)及操作性等方面具有顯著的優(yōu)勢，20世紀末Quinlan等[14]首次提出了嚙齒類動物模型作為研究勃起功能的模型，通過選取適當?shù)念l率電刺激CN誘發(fā)勃起，途經(jīng)換能裝置處理并記錄ICP變化，奠定了大鼠模型作為研究勃起功能動物模型和電刺激CN時記錄ICP差異作為評估勃起功能生理指標的實驗基礎(chǔ)[15-16]。電刺激ICP測定與交配實驗、直接性行為觀察、生理遙測等測定方法相比，具有壓力測定裝置低廉、實驗結(jié)果主觀性少且結(jié)果可重復(fù)等優(yōu)勢[3,8-9]。因此，在一定程度上將電刺激ICP測定視作ED實驗研究中的首選評估方案對治療方法及藥物進行評估分析，建立具有可操作性、重復(fù)性、客觀性的ICP測定實驗方法，對于深層次研究治療勃起功能障礙相關(guān)生理藥理具有重要意義。

測量ICP時，連接刺入陰莖海綿體針頭的材料通常有PE管和VN[9,11]。VN在其持針處具有蝶形捏持處，因此在進行插管時操作的便利性相較于自制PE管具有優(yōu)勢。VN在臨床上使用普遍，其獲取方便并且價格低廉。而PE管是由高密度聚乙烯構(gòu)成，在測量血壓等生理數(shù)據(jù)時對血流有良好的抗沖擊性，是動物實驗中連接壓力換能裝置的首選材料。本研究比較兩種材質(zhì)對ICP測量數(shù)據(jù)結(jié)果的影響以及實驗的便捷性進行初步探討。勃起功能數(shù)據(jù)顯示使用PE-50管針頭與VN針頭記錄的數(shù)據(jù)(表1)，最大值ICP、ICP/MAP和AUC作為評估勃起功能障礙最常用的指標[17]，在NC組及DM組中使用兩種材質(zhì)統(tǒng)計得出數(shù)據(jù)均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而在使用VN在NC組和DM組中測得的起峰斜率指標與PE-50管測得指標具有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05與P< 0.01)。VN的起峰斜率指標與PE-50管的相比具有差異性，由于材質(zhì)密度沒有PE管材質(zhì)致密，對于壓力的升高存在緩沖作用。因此若將起勃時間作為評估勃起功能障礙的一項指標，應(yīng)當首選PE-50管針材質(zhì)的傳導(dǎo)材料。

結(jié)合實驗過程，本課題組對ICP測定過程提出以下建議：①電刺激環(huán)節(jié)，可由操作者手持雙極電刺激鉤，輕微提拉暴露充分的CN處于懸空狀態(tài)1 min，同時記錄 ICP數(shù)據(jù)。②雙極電刺激鉤刺激時需注意不能觸碰到盆腔肌肉，以避免肌肉收縮對ICP的影響。主要是由于電刺激電壓與頻率過高時會誘發(fā)盆底肌肉收縮，而盆底肌肉的收縮會導(dǎo)致勃起反應(yīng)時最大值ICP的異常增加[17]。若直接放置雙極刺激頭于刺激部位進行刺激，勢必直接觸碰并刺激到盆底肌肉進而影響測量結(jié)果。③雙極電刺激鉤刺激神經(jīng)多次后，電刺激鉤頂端會有血凝塊包裹刺激鉤，需及時對電鉤頂端進行清理，保證釋放出的電刺激參數(shù)不受干擾。④針對陰莖海綿體插管實驗不熟練的操作者，建議使用具有握柄的靜脈輸注針操作測量ICP，能進一步提高置管的成功率。⑤使用眼科鑷分離出CN后，采用材質(zhì)較軟的PE-10管進行定位，避免大鼠肌肉意外抽動時崩斷CN。

綜上所述，基于前面研究者們的ICP檢測步驟并結(jié)合自己的實驗步驟對實驗操作過程提出優(yōu)化，以期為更多從事ED方向研究的研究者提供經(jīng)驗，同時對PE管和VN兩種置管材質(zhì)測量數(shù)據(jù)比較后，兩者均可用于ICP的檢測。