紅外熱像技術(shù)在小鼠陽虛證研究中的運(yùn)用及其評價體系

錢宏梁，潘志強(qiáng)，方肇勤

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

中醫(yī)證候表征的量化研究是學(xué)術(shù)界探索的重要領(lǐng)域，其中，寒熱屬性是中醫(yī)辨別病邪性質(zhì)、機(jī)體的陰陽盛衰及病屬外感或內(nèi)傷的重要依據(jù)。寒即畏寒怕冷，臨床腎陽不足者可能會出現(xiàn)手足、腰部、膝蓋等部位的發(fā)涼或怕冷；熱即身熱感或體溫升高，臨床陰虛內(nèi)熱者顏面部易出現(xiàn)潮紅、烘熱或手足心發(fā)熱。由此可見，中醫(yī)證候?qū)贌嵝詴r既有主觀性肌膚發(fā)熱感覺，也會出現(xiàn)客觀上體溫升高體征，體溫升高可以通過溫度計準(zhǔn)確刻畫，然而主觀上的肌膚熱感則主要通過患者的陳述獲得，其模糊性不利于證候的準(zhǔn)確判別。

隨著紅外熱像技術(shù)的成熟與運(yùn)用，醫(yī)學(xué)上已有大量紅外測溫的研究，陳振相等[1]紅外熱像儀對健康人的面部進(jìn)行了觀測，倪金霞等[2]用紅外熱成像儀研究健康人各臟腑的溫度范圍和能量分布。這些探索給中醫(yī)證候?qū)嶒?yàn)研究提供有益的借鑒，有助于寒熱信息在證候判別中的定量化。當(dāng)機(jī)體處于熱量不足或功能衰減狀態(tài)下，紅外輻射少可能表現(xiàn)出寒證；一旦熱量過剩或代謝旺盛時，紅外輻射多則可能呈現(xiàn)類似熱證。如“陽虛則外寒，陰虛則內(nèi)熱，陽盛則外熱，陰盛則內(nèi)寒”(《素問·調(diào)經(jīng)論》)所言，紅外熱像技術(shù)可以很好地的量化檢測體表寒熱情況作為評價中醫(yī)“陽”盛衰程度的手段非常契合，但在實(shí)驗(yàn)動物證候模型的研究方面鮮有報道?；诒菊n題組長期對于實(shí)驗(yàn)小鼠的診法和辨證論治方法學(xué)的研究[3-5]，本實(shí)驗(yàn)圍繞小鼠的“陽”盛衰程度開展了對典型的糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的藥源性證候模型小鼠的探索，通過紅外熱像技術(shù)對小鼠體表頭部最高溫度、體表尾部最低溫度和軀干平均溫度3個溫度指標(biāo)進(jìn)行了研究，茲報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性ICR小鼠，SPF級，120只，體質(zhì)量(18～20)g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房【SYXK (滬) 2014-0008】。實(shí)驗(yàn)動物倫理審批號：SZY201803012。

1.1.2 試劑與儀器

氫化可的松(hydrocortisone，HY)，白色結(jié)晶粉末，分子量362.46，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品(批號66003632)。醋酸潑尼松龍片(prednisolone)(國藥準(zhǔn)字H31020771)、醋酸地塞米松片(dexamethasone)(國藥準(zhǔn)字H31020793)均購自上海上藥信誼藥廠有限公司。

ThermaCAM P30型紅外熱像儀器(購自美國FLIR公司)用于檢測體表紅外溫度。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)，當(dāng)小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定至30 g左右，開始實(shí)驗(yàn)。

第一批實(shí)驗(yàn)：40只分為正常對照組、極低劑量(0.33 mg/(kg·bw))氫化可的松組、低劑量(0.66 mg/(kg·bw))氫化可的松組、中劑量(3.3 mg/(kg·bw))氫化可的松組和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))氫化可的松組，每組8只。

第二批實(shí)驗(yàn)：40只分為正常對照組、極低劑量(0.25 mg/(kg·bw))潑尼松龍組、低劑量(0.5 mg/(kg·bw))潑尼松龍組、中劑量(2.5 mg/(kg·bw))潑尼松龍組和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))潑尼松龍組，每組8只。

第三批實(shí)驗(yàn)：40只分為正常對照組、極低劑量(0.0125 mg/(kg·bw))地塞米松組、低劑量(0.05 mg/(kg·bw))地塞米松組、中劑量(0.25 mg/(kg·bw))地塞米松組和高劑量(1.25 mg/(kg·bw))地塞米松組，每組8只。

各組按照相應(yīng)的藥物劑量灌胃，每天1次，連續(xù)14 d；正常對照組灌胃等體積的滅菌水。

1.2.2 紅外熱像儀檢測小鼠體表溫度的標(biāo)準(zhǔn)化方法

在實(shí)驗(yàn)第14天，檢測各組小鼠體表紅外溫度，具體方法如下：

1)將被檢測的實(shí)驗(yàn)小鼠與紅外熱像儀至于環(huán)境溫度22℃的室內(nèi)，室內(nèi)移除其他干擾紅外熱像儀的設(shè)備或儀器。

2)開啟紅外熱像儀，設(shè)定以下相關(guān)參數(shù)：FOV視場23(單位：角秒)，調(diào)色板以紅色為主，發(fā)射率e為0.97，相對濕度65%，鏡頭為200 μm近焦鏡頭，手動聚焦。

3)準(zhǔn)備一個10 cm × 6 cm面積的泡沫塑料材質(zhì)平臺供小鼠站立。

4)調(diào)整紅外熱像儀鏡頭中心與小鼠側(cè)腹部在同一水平，且距離60 cm。

5)將小鼠置于泡沫塑料材質(zhì)平臺上。

6)調(diào)整焦距使得小鼠側(cè)面輪廓清晰并使其處于紅外熱像儀圖像中心區(qū)域。

7)等待小鼠調(diào)整到較好的姿勢時，拍攝小鼠紅外熱像圖，并保存圖片。

1.2.3 小鼠體表紅外溫度的評價指標(biāo)建立

采用ThermaCAM Reporter 2000專業(yè)版軟件對小鼠紅外熱像圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過軟件采集三個溫度指標(biāo)進(jìn)行分析：

1)頭部最高溫度(即為圖1中A小鼠頭部區(qū)域中的溫度最大值)

2)軀干平均溫度(即為圖1中B小鼠軀干區(qū)域的平均值)

3)尾部最低溫度(即圖1中C小鼠尾根部區(qū)域可以選取到的最小值)。

圖1 小鼠紅外熱像圖分析數(shù)據(jù)示意圖Figure 1 Schematic diagram indicating the three sites of infrared thermogram analysis data of a mouse

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氫化可的松對小鼠不同部位紅外溫度影響(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，氫化可的松給藥14 d后，不同劑量氫化可的松組小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均出現(xiàn)不同程度的下降。其中極低、低、中、高劑量組小鼠頭部最高溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；極低、低、中、高劑量組小鼠軀干平均溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；極低、低、中、高劑量組小鼠尾部最低溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01),見圖2。

2.2 潑尼松龍對小鼠不同部位紅外溫度影響(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，潑尼松龍給藥14 d后，極低劑量潑尼松龍組小鼠頭部最高溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，軀干平均溫度和尾部最低溫度未出現(xiàn)顯著差異；低、中、高劑量潑尼松龍組小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均未出現(xiàn)顯著差異，見圖3。

2.3 地塞米松對小鼠不同部位紅外溫度影響(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，地塞米松給藥14 d后，不同劑量地塞米松組小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均出現(xiàn)不同程度的下降。其中低、中、高劑量小鼠頭部最高溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；低、中、高劑量組小鼠軀干平均溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；低、中、高劑量組小鼠尾部最低溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，見圖4。

注：不同劑量氫化可的松：極低劑量(0.33 mg/(kg·bw))、低劑量(0.66 mg/(kg·bw))、中劑量(3.3 mg/(kg·bw))和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))。與正常對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。另“氫可”即氫化可的松。圖2 氫化可的松小鼠紅外熱圖以及數(shù)據(jù)柱狀圖Note. Different doses of hydrocortisone: very low dose (0.33 mg/(kg·bw)), low dose (0.66 mg/(kg·bw)), medium dose (3.3 mg/(kg·bw)) and high dose (12.5 mg/(kg·bw)). Compared with the normal control group,* P<0.05;** P<0.01.“HY” means hydrocortisone.Figure 2 Infrared heat map and data histogram of the hydrocortisone-treated mice

注：不同劑量潑尼松龍：極低劑量(0.25 mg/(kg·bw))、低劑量(0.5 mg/(kg·bw))、中劑量(2.5 mg/(kg·bw))和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))。另“潑松”即潑尼松龍。圖3 潑尼松龍小鼠紅外熱圖以及數(shù)據(jù)柱狀圖Note. Different doses of prednisolone: very low dose (0.25 mg/(kg·bw)), low dose (0.5 mg/(kg·bw)), medium dose (2.5 mg/(kg·bw)) and high dose (12.5 mg/(kg·bw)). “PL” means prednisolone.Figure 3 Infrared heat map and data histogram of the prednisolone-treated mice

注：不同劑量地塞米松：極低劑量(0.0125 mg/(kg·bw))、低劑量(0.05 mg/(kg·bw))、中劑量(0.25 mg/(kg·bw))和高劑量(1.25 mg/(kg·bw))。另“地米”即地塞米松。圖4 地塞米松小鼠紅外熱圖以及數(shù)據(jù)柱狀圖Note. Different doses of dexamethasone: very low dose (0.0125 mg/(kg·bw)), low dose (0.05 mg/(kg·bw)), medium dose (0.25 mg/(kg·bw)) and high dose (1.25 mg/(kg·bw)). “DXM” means dexamethasone.Figure 4 Infrared heat map and data histogram of the dexamethasone-treated mice

3 討論

3.1 紅外熱像技術(shù)簡介

紅外熱像儀利用物體的紅外輻射把熱能轉(zhuǎn)換成電信號，再掃描成像，然后通過軟件可以實(shí)現(xiàn)對圖像任何點(diǎn)或區(qū)域的溫度精確分析。由于紅外熱像技術(shù)具有非接觸性測溫、測溫速度快、以熱分布圖像直觀呈現(xiàn)等諸多優(yōu)點(diǎn)[6]，其在軍事領(lǐng)域、高壓電網(wǎng)工業(yè)及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用[7]。近幾十年來，紅外熱像技術(shù)在醫(yī)療診斷、腫瘤研究、疼痛研究、神經(jīng)定位、針刺效應(yīng)及人體異常信息的無創(chuàng)監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

3.2 紅外熱像技術(shù)在中醫(yī)藥證候研究中的實(shí)踐

由于寒熱屬性是中醫(yī)證候的重要特性，雖然臨床表現(xiàn)并非所有的“陽”盛衰證候都有體表溫度的變化，但體表溫度下降是陽虛的基礎(chǔ)見證。近年來，有報道紅外熱像儀在中醫(yī)證候的量化研究方面進(jìn)行了嘗試，陳振相等[1]用紅外熱像儀對健康人的面部進(jìn)行了觀測，發(fā)現(xiàn)面部諸臟腑面部反映區(qū)的紅外輻射量有所差異。劉黎青等[8]應(yīng)用紅外熱像技術(shù)觀察不同中醫(yī)辨證分型的紅外舌圖特征及冷熱溫度負(fù)荷變化規(guī)律。周嫻等[9]運(yùn)用紅外熱像技術(shù)研究中醫(yī)五臟寒熱證素特征與紅外熱像圖之間的關(guān)系。李洪娟等[10]則詳細(xì)論述中醫(yī)證候理論與熱力學(xué)理論的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，闡述采用熱力學(xué)方法研究中醫(yī)證候的基本原則、方法、技術(shù)、手段，以及熱力學(xué)方法研究中醫(yī)證候的特點(diǎn)和優(yōu)勢等，提出證候熱力學(xué)研究概念。

在動物實(shí)驗(yàn)方面也有部分紅外熱像技術(shù)運(yùn)用的報道，袁永明等[11]對寒證熱證大鼠模型的紅外熱圖進(jìn)行了研究。馬小鑫[12]通過紅外熱像技術(shù)在大鼠上的實(shí)踐建立了中藥寒熱藥性的研究方法。孫麗斌等[13]對紅外熱圖與腫瘤中醫(yī)證候相關(guān)性作了研究。提示紅外熱像技術(shù)是研究中醫(yī)證候?qū)傩缘囊环N有益技術(shù)手段。

3.3 本研究采用紅外熱像技術(shù)對糖皮質(zhì)激素藥源性虛證小鼠體表溫度的分析

本課題前期做過多次探索，短期(4 d內(nèi))使用糖皮質(zhì)激素藥物體重顯著下降陰虛見證顯著。長期(7 d以上)使用糖皮質(zhì)激素藥物體重下降減緩，體表溫度下降等。兩周為糖皮質(zhì)激素影響的主要變化周期，兩周后趨于穩(wěn)定變化不大。實(shí)驗(yàn)中三個藥物極低劑量即為臨床藥物參考用量按體重折算到小鼠所得，高劑量參考文獻(xiàn)該藥物造模常用量。低、中劑量則選取極低劑量和高劑量之間地合適劑量。

本研究運(yùn)用紅外熱像技術(shù)檢測了三種糖皮質(zhì)激素造模后小鼠的體表溫度變化?？紤]到所采集圖像信息能盡可能全面反映小鼠的體表溫度差異，我們選擇了拍攝小鼠自然站立狀態(tài)下側(cè)腹部整體輪廓圖像，包括小鼠頭面部、頸項(xiàng)部、側(cè)腹部、全尾等區(qū)域溫度，且背部與腹部的切緣溫度可以有效顯示。其中，小鼠頭部的眼睛區(qū)域溫度最高、尾部溫度通常最低、而側(cè)腹部溫度從頭到尾逐步降低。根據(jù)以上現(xiàn)象，我們選取了頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾根部最低溫度三個指標(biāo)進(jìn)行分析。

結(jié)果表明，給予氫化可的松和地塞米松后小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均出現(xiàn)下降，而潑尼松龍對小鼠體表溫度影響不明顯。另外三批實(shí)驗(yàn)中我們也同步檢測了小鼠的腋溫、曠場活動度、體重等，腋溫變化不顯著，(故未給出具體數(shù)據(jù))，曠場活動度有一定程度的下降，體重在給藥后下降7 d后下降減緩。另外由于糖皮質(zhì)激素藥理作用復(fù)雜，直接作用機(jī)體可能造成類似陰虛陽亢征兆，長期使用造成機(jī)體出現(xiàn)陽虛見證，具有直接和間接雙重影響。中、高劑量下小鼠體表溫度略有升高可能是由于氫化可的松直接作用機(jī)體造成，但是用藥14 d后氫化可的松各劑量組體表溫度均顯著低于正常對照組是明確的。

基于本研究大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度三個指標(biāo)可以反映出小鼠整體體表溫度的變化，且這三個溫度指標(biāo)的變化具有一致性。其中，頭部最高溫度能更好反映小鼠是否有陽亢見證(是否頭部溫度過高)，中醫(yī)認(rèn)為頭為諸陽之會，所有的陽經(jīng)都匯集到頭部，小鼠頭部體表溫度最高符合中醫(yī)理論；而尾根部最低溫度反映小鼠的陽虛見證(是否尾根部溫度過低)；軀干平均溫度則更加反映小鼠整體上的體表溫度變化。此外，小鼠的體表最高與最低體溫的溫差、或頭部溫度高于平均溫度的比值等相關(guān)轉(zhuǎn)化指標(biāo)也有助于深刻揭示溫度變化的靈敏性，有待于深入探索。

由此得出結(jié)論(1)紅外熱像技術(shù)可以評估實(shí)驗(yàn)小鼠 “陽”盛衰程度。(2)氫化可的松和地塞米松可誘發(fā)藥源性虛證小鼠類似陽虛的外寒征象，且隨著用藥時間和劑量的增加而小鼠陽虛外寒征象越顯著。