大鼠高尿酸血癥模型的建立與研究

李媛媛，周海燕，吳綠英，莫賢煒，李晶

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006)

高尿酸血癥(hyperuricemia)是嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少，致血液中尿酸濃度不正常升高的現(xiàn)象，一般認為人類體內(nèi)血尿酸鹽達到416 μmol/L時應(yīng)考慮高尿酸血癥[1]。高尿酸血癥為嘌呤代謝紊亂性疾病[2-3]，過量糖、脂肪、蛋白質(zhì)、鹽的攝入及大量飲酒與患病率增加有重要關(guān)系。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活習慣的改變，高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化[4]。一些研究結(jié)果表明，血尿酸升高與腎疾病、高血壓、動脈粥樣硬化程度、腦卒中、心血管事件的發(fā)生率和死亡率等呈獨立正相關(guān)，同時，一些心血管病患者的尿酸也隨著病情的發(fā)展相應(yīng)增加[5-6]。有學者對西班牙1564名健康男性進行研究，多因素回歸分析結(jié)果顯示，高尿酸血癥與血糖、肥胖明顯相關(guān)，比值分別為2.69和2.5[7]。目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多學者進行高尿酸血癥動物模型的造模研究，但有關(guān)高尿酸血癥是否影響心血管系統(tǒng)并進而引發(fā)繼發(fā)性病變的造模研究尚少。

本文采用氧嗪酸鉀聯(lián)合高糖高脂飼料及氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏飼料進行造模，通過血清尿酸(uric acid，UA)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐酸(creatinine，Cr)水平的檢測來考察與評價其建立持續(xù)、穩(wěn)定的大鼠高尿酸實驗動物模型的可行性，并同時采用胰島素(insulin，INS)，血糖(glucose，GLU)，甘油三酯(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein chesterol，LDL-C)等指標來比較不同高尿酸血癥造模法對心血管的繼發(fā)性損害的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠32只，7～9周齡，體重(180±20)g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心【SCXK(粵)2013-0034】。動物模型的指標及標本的采集均在廣東藥科大學實驗動物中心SPF級鼠類實驗室進行【SYXK(粵)2017-0125】，且經(jīng)廣東藥科大學實驗動物中心倫理委員會審批(受理編號：SPF2017097)。標準鼠籠飼養(yǎng)溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

普通飼料由廣東藥科大學實驗動物中心提供，高糖高脂飼料(63.0%大小鼠維持飼料、20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等)購自南通特洛菲飼料科技有限公司，酵母菌飼料為酵母膏按照1∶4均勻拌入粉碎的普通飼料中混勻而成，壓制成顆粒，輻射滅菌，由南通特洛菲飼料科技有限公司制作。

1.1.2 試劑與儀器

酵母膏購自北京奧博星生物科技有限公司，氧嗪酸鉀購自上海源葉生物科技有限公司。UA、Cr、BUN、GLU、INS等指標均由廣州市第十二人民醫(yī)院檢驗科進行檢測(UA、Cr、BUN、GLU：全自動生化分析儀，西門子ADVIA2400；INS：羅氏電發(fā)光分析儀，COBAS602)；大鼠心臟、腎、肝等組織委托武漢賽維爾生物科技公司進行HE染色。

1.2 方法

將32只SPF級雄性SD大鼠隨機分成正常對照組(Group C)，氧嗪酸鉀模型組(Group M1)，氧嗪酸鉀聯(lián)合高糖高脂飼料模型組(Group M2)，氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏飼料模型組(Group M3)，每組8只，連續(xù)造模3周。三個模型組每日按照750 mg/kg體重給予氧嗪酸鉀灌胃，C組按同體積溶媒(0.5% CMC-Na)灌胃。同時，C組及M1組給予普通飼料喂養(yǎng)，M2組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，M3組給予酵母膏飼料喂養(yǎng)，實驗連續(xù)21 d。每7天大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)乙醚麻醉后進行眼內(nèi)眥取血2 mL，室溫靜置2 h后離心分離(4000 r/min，10 min，4℃)，取上層血清-80℃保存待測。第21天實驗前動物禁食不禁水12 h后，各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，室溫靜置2 h后離心分離(4000 r/min，10 min，4℃)，取上層血清-80℃保存待測。取血后，立即取大鼠心臟、腎、肝置于福爾馬林杯，加入4%甲醛溶液浸泡，待測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

4組大鼠實驗開始時(第0天)體重無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗第10天開始，M3組動物毛發(fā)光滑性較其他三組較差，且糞便明顯增多(更換墊料次數(shù)增多)，并伴有刺鼻的酸臭味，同時各模型組大鼠均有表現(xiàn)精神萎靡，食欲不振，且敏感易怒。在整個實驗周期里，4組大鼠體重同步增加，組間無明顯差異(P>0.05，表1)。

2.2 UA、BUN及Cr的變化情況

如表2所示，與正常對照組相比，其他三組自實驗第7天測得的血尿酸水平較正常組明顯升高，提示本實驗采用的氧嗪酸鉀灌胃法造模成功(P<0.05)。此外，隨著實驗進行，造模組的血尿酸水平持續(xù)升高，在實驗終點(第21天)，所有造模組的血尿酸水平較正常組提高約2倍，且模型三組組間比較無顯著性差異。但造模三組大鼠的Cr及BUN在整個實驗中均未表現(xiàn)出較正常對照組的明顯改變(P>0.05，見表3，4)。

2.3 血糖血脂相關(guān)血清指標的變化

實驗終點日取血測定大鼠的GLU、INS、TG及LDL-C水平，結(jié)果如表5所示。與正常組相比，雖無顯著性差異，但造模三組均表現(xiàn)出不同程度的GLU水平升高和相應(yīng)的INS水平降低趨勢，其中M2和M3組的INS水平與C組相比有明顯差異(P<0.05)，而三個模型組之間無顯著性差異；與正常組相比，造模三組均表現(xiàn)出不同程度的TG水平提高，其中M2組的差異最具顯著性(P<0.01)，M3組的TG水平明顯高于M1組，但在本實驗中，僅有M2組能觀察到LDL-C水平的明顯升高(P<0.01)。其他三組兩兩相比均無顯著性差異。

表1 4組大鼠不同時間體重的變化Table 1 Changes in body weight of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

表2 4組大鼠不同時間的尿酸水平Table 2 Uric acid levels of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

注：和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.

表3 4組大鼠不同時間的肌酐酸水平Table 3 Creatinine levels of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

表4 4組大鼠不同時間的尿素氮水平Table 4 Blood urea nitrogen levels of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

組別GroupsGLU(mmol/L)INS(pmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)C組Group C9.4±0.33.5±0.20.41±0.10.3±0.01M1組Group M110.6±1.42.9±0.40.53±0.10.3±0.05M2組Group M212.2±0.92.7±0.3?0.78±0.2??1.8±0.47??M3組Group M311.8±0.92.8±0.2?0.67±0.2?0.3±0.05

注：和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.

2.4 腎組織的病理改變

如圖1所示，C組的大鼠組織染色均勻，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細胞排列緊密，未見明顯炎癥。造模三組大鼠腎組織皮質(zhì)內(nèi)均有不同程度病理性改變，表現(xiàn)為少量腎小管上皮細胞脫落，可見腎小管擴張。此處挑選出損傷程度較嚴重的大鼠腎切片進行展示。

2.5 肝組織的病理改變

如圖2所示，C組肝索結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，肝細胞胞質(zhì)豐富、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝竇未見明顯擴張或擠壓，未見明顯炎癥。與C組相比，M1組和M3組無顯著性區(qū)別，仍表現(xiàn)為正常態(tài)的肝組織結(jié)構(gòu)。但M2組大鼠肝組織發(fā)生較明顯病變，表現(xiàn)為中央靜脈周圍可見少量肝細胞脂肪變性，胞質(zhì)中可見大小不一的圓形空泡，肝竇變窄，肝細胞索不明顯。

2.6 心臟組織的病理改變

如圖3所示，C組、M1組及M2組的心臟組織形態(tài)組織染色均勻，心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列規(guī)則、分界清晰，間質(zhì)未見明顯異常，未見明顯炎癥。而3/8的M3組大鼠的心臟組織發(fā)生病變，表現(xiàn)在可見少量心肌纖維水腫，胞質(zhì)疏松淡染，此處挑選病變程度最為嚴重的M3組大鼠進行展示。

3 討論

高尿酸血癥的發(fā)生，主要由于尿酸生成增多或排泄較少所致，所以復制動物模型，應(yīng)該主要從這兩個途徑入手。氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，作為化學誘導劑可以抑制尿酸分解，加強血清中尿酸水平，造成高尿酸血癥動物模型[8-9]。有文獻報道[10]，腹腔注射氧嗪酸鉀會使大鼠長期處于應(yīng)激狀

注：黑色箭頭標示腎小管及其上皮細胞病變部位。圖1 各組大鼠腎組織病理染色示意圖(HE 染色)Note. The black arrows point to the renal tubules and their epithelial cell lesions.Figure 1 Comparison of the pathological changes of renal tissues in each group of rats (HE staining)

注：黑色箭頭標示肝細胞脂肪病變部位。圖2 各組大鼠肝組織病理染色示意圖(HE染色)Note. The black arrows point to the hepatocyte lesions.Figure 2 Comparison of the pathological changes of liver tissues in each group of the rats (HE staining)

注：黑色箭頭標示心肌纖維病變部位。圖3 各組大鼠心臟組織病理HE染色示意圖(HE染色)Note. The black arrow points to the myocardial fiber lesion.Figure 3 Comparison of the pathological changes of heart tissues in each group of the rats (HE staining)

態(tài)下，且易造成腹腔積水、腹膜硬化等不良后果，有悖于動物倫理，而飼喂法相對穩(wěn)定性欠佳；氧嗪酸鉀灌胃法穩(wěn)定性較好，可用于制作長期高尿酸血癥大鼠模型。故本次實驗，筆者采用氧嗪酸鉀灌胃法。而酵母膏無毒，屬于高嘌呤類食物，酵母在體內(nèi)充分水解產(chǎn)生含氮的有機堿(包括嘌呤堿類、嘧啶堿類等)，引起嘌呤代謝紊亂，使尿酸增多[11]。

有研究表明，高尿酸血癥與高血糖、高血脂等心血管疾病的發(fā)生是呈顯著的正相關(guān)[12-13]，有部分學者已成功復制高尿酸血癥模型，并且對高尿酸血癥與心血管病變之間的關(guān)系進行系列研究[14-15]。

經(jīng)過查閱文獻[16-17]，筆者決定采用氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏建立高尿酸血癥模型，同時研究大鼠是否伴隨著產(chǎn)生心血管病變。采用酵母膏飼料可模擬人服用高嘌呤類食物時引起嘌呤代謝紊亂導致尿酸升高，同時給予氧嗪酸鉀主要是抑制大鼠體內(nèi)的尿酸酶，排除尿酸酶的干擾，二者聯(lián)合造?？梢宰畲蟪潭饶M人類產(chǎn)生高尿酸血癥的病發(fā)原因。由于飼料中含有易被氧化的脂肪成分，因此嚴格控制大鼠每日給予飼料每只35 g，同時次日更換新鮮飼料以確保實驗規(guī)范性，在本實驗中未出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象。由于造模后大鼠會出現(xiàn)一個短暫性的尿酸升高隨后降低的現(xiàn)象，為了驗證是否出建立一種尿酸值高、維持時間長、模型穩(wěn)定特點的大鼠模型，因此本實驗采用禁食不禁水12 h后采血。此外，空腹INS水平和血清TG含量等均可作為血糖、血脂代謝指標，因此本實驗中統(tǒng)一在禁食不禁水12 h后采血[18-19]。

本次實驗為每7天進行一次大鼠眼內(nèi)眥取血，所得血清量較少，故僅測定UA、BUN、Cr等三個指標，用于檢測高尿酸血癥是否造模成功；而實驗最后一天，采用大鼠腹主動脈取血，所得血清量較多，因此增加了檢測的指標，比較GLU、INS、TG、LDL-C等水平的差異用于判定大鼠在患有高尿酸血癥的同時是否伴隨著產(chǎn)生血糖、血脂代謝異常。本實驗三個模型組都是氧嗪酸鉀灌胃給藥，但給予飼料不同，M1組給予普通飼料，M2組給予高糖高脂飼料，M3組給予酵母膏飼料。通過M1組及M3組可比較氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏造模相比氧嗪酸鉀單獨造模的優(yōu)勢，比較模型三組間的GLU、INS、TG等水平，可檢測M1組及M3組大鼠是否伴隨著血糖、血脂代謝紊亂。

實驗結(jié)果表明，各模型組的UA水平顯著升高，實驗第7天時M1及M2組與正常組比較UA明顯升高(P<0.05)，而M3組UA則顯著性地升高(P<0.01)；實驗第14天時，M1組與第7天相比，尿酸呈現(xiàn)下降趨勢，由此可看出受到大鼠體內(nèi)尿酸酶的影響，氧嗪酸鉀單獨造模表現(xiàn)出模型不穩(wěn)定的現(xiàn)象，而M3組UA則呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢；實驗第21天時，各模型組的UA與正常組對比均顯著性地升高(P<0.01)，但M1組大鼠的UA整體偏差較大，而M3組相對而言偏差較小，進一步說明了氧嗪酸鉀及酵母膏聯(lián)合造模可建立一種尿酸升高、維持時間長、模型穩(wěn)定等特點的大鼠長期高尿酸血癥模型。而在整個實驗周期，各組大鼠的Cr、BUN水平無明顯改變，目前已有文獻報道和臨床證據(jù)顯示[20]，UA和Cr、BUN并無明顯相關(guān)性，臨床上有大量高尿酸血癥患者，其Cr和BUN與正常人相當。造模三組都表現(xiàn)出GLU水平有不同程度的升高趨勢，且M3組表現(xiàn)出與M2組相當?shù)腎NS水平降低，提示M2與M3組存在血糖代謝紊亂。此外，M2組LDL-C含量顯著地升高，LDL-C的增高不利于脂質(zhì)代謝故引發(fā)M2組TG增高，形成高脂血癥，說明了M2組大鼠通過高脂飲食誘導了高血脂狀態(tài)，而M1組及M3組大鼠沒有明顯的高血脂狀態(tài)，且比較這四組大鼠的肝HE染色結(jié)果，也僅僅有M2組大鼠發(fā)生了明顯的脂肪肝病變現(xiàn)象，進一步表明只有M2組大鼠出現(xiàn)了血脂紊亂。

本實驗選擇了氧嗪酸鉀聯(lián)合不同飼料制備大鼠高尿酸血癥模型，與“氧嗪酸鉀+普通飼料”的M1 組相比，“氧嗪酸鉀+高糖高脂飼料”的M2組表現(xiàn)為明確的高尿酸血癥合并血糖血脂代謝紊亂，“氧嗪酸鉀+酵母膏飼料”的M3組表現(xiàn)為明確的高尿酸血癥合并血糖代謝紊亂，且該組部分大鼠的腎、心臟等器官發(fā)生病變，提示該造模方法可用于“尿酸升高-繼發(fā)性血糖紊亂”相關(guān)的心血管疾病的大鼠模型研究，而本組在本實驗中未檢測出血脂異常，可能與實驗周期略短相關(guān)，需要后期進一步優(yōu)化與探討。