甲氨蝶呤代謝酶基因多態(tài)性與類風濕關節(jié)炎患者療效的相關性研究*

束 慶，曹 智，，王丹丹，朱懷軍，葛泳含，劉蘊星，姚 瑤，孫 雷，葛衛(wèi)紅**

1 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 藥學部，南京 210008；2 徐州醫(yī)科大學附屬邳州醫(yī)院 藥學部，徐州 221300；3 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 風濕免疫科，南京 210008

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病，全世界發(fā)病率約為0.24%[1]，我國大陸地區(qū)患病率為0.2%～0.4%[2]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）及美國風濕病學會（ACR）推薦治療RA 的一線藥物。關節(jié)損傷發(fā)生在類風濕關節(jié)炎病程的早期[3，4]，治療RA 首要目標是對疾病的早期控制，防止疾病進展對關節(jié)結構的破壞和功能的影響。但是，服用MTX 需6 個月才達到血藥濃度穩(wěn)態(tài)[5]，方可判定療效。此外，研究顯示，約30%的患者對MTX 的治療無效[6-8]。因此，MTX 在臨床用藥的困難是：能否預知MTX 對患者的療效，從而能夠早期有效控制疾病的活動。

關于MTX 在體內的代謝及藥理機制的發(fā)揮過程如圖1 所示：MTX 通過還原型葉酸轉運載體-1（reduced folate carrier 1，RFC-1）運送到細胞內，進而谷氨酸基團通過多聚谷氨酰胺合成酶（folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS） 添加到MTX上，轉變?yōu)槎嗑酃劝彼峄装钡剩∕TXPGn）[9]；而γ-谷氨酰水解酶（γ-glutamyl hydrolase，GGH）則可移除MTXPGn 末端的多聚谷氨酸，使之恢復成單聚谷氨酸的形式，然后很快地被三磷酸腺苷結合盒轉運體（ATP－binding cassette ABC 轉運體）的膜蛋白家族轉運出細胞。胞內的MTXPGn 可通過抑制：①胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）干擾蛋白質的合成。②抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）使四氫葉酸無法轉化為二氫葉酸，進一步導致5，10-亞甲基四氫葉酸無法在亞甲基四氫葉酸還原酶 （5，10 -methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的催化作用下、形成5-甲基四氫葉酸鹽，最終引起DNA 甲基化的減少。③抑制5-氨基咪唑-4 -氨甲酰核苷酸轉甲酰酶 （5 -aminoimidazole -4 -carboxamide ribonucleotide transformylase，ATIC），影響嘌呤的合成。

在甲氨蝶呤通路中，各種代謝酶的基因多態(tài)性可能影響細胞內MTXPGn 對葉酸抑制作用的發(fā)揮效果[10]。但是，目前關于中國人群相關基因的多態(tài)性的研究較少，因此，本研究通過檢測MTX 代謝酶基因多態(tài)性在中國RA 患者中的分布情況，探討基因多態(tài)性與MTX 療效的相關性，為臨床對RA 患者的個體化用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與設備

Verity 96well PCR 儀；Gene Genius 凝膠成像儀（Syngene 公司）；3730XL 測序儀 （ABI 公司）；H6-1 電泳槽 （上海精益有機玻璃制品儀器廠）；DYY-8C 電泳儀（北京六一儀器廠）；HC-2518R 冷凍離心機 （BBI 公司）；TGL-14G 臺式高速離心機（上海醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤每片2.5 mg，上海上藥信誼藥廠有限公司。Pfu DNA 聚合酶、DNA 提取試劑盒、PCR 產物純化回收試劑盒、PCR 擴增試劑、無乙水醇、異丙醇、丙三醇等均購自生工生物工程（上海）公司。

1.3 研究對象

選取2017 年3～11 月在醫(yī)院門診信息系統(tǒng)記錄且診斷為RA 的患者，共納入109 例。本實驗符合人體試驗委員會制定的倫理學標準，并按照鼓樓醫(yī)院倫理委員會批準的標準執(zhí)行。

1.3.1 入組標準、排除標準 入組標準：符合ACR2010年RA 診斷標準；能規(guī)律服用MTX（10 mg/周）至少3 個月，且合并用藥為不影響MTX 代謝的免疫抑制劑。排除標準：聯(lián)合其他抗風濕藥物治療者；有嚴重心、腎等重要臟器損傷和血液系統(tǒng)疾病者（WBC<4.0×109/L，Hb<80 g·L-1，PLT<70×109/L）；肝功能ALT、AST 超過正常上限1.5 倍者；血肌酐超過正常上限者。

排除3 個月初判時ESR<20 mm·h-1、但是6 個月未達到有效標準的患者。

1.3.2 療效評價 療效判定標準為以下二種預定結果之一：（1）有效患者（穩(wěn)定劑量的MTX 治療至少6 個月，治療6 個月后的血沉（ESR）<20 mm·h-1）；（2）無效患者（穩(wěn)定劑量的MTX 治療至少3 個月，ESR 較用藥前改善率低于20%）。

1.4 實驗方法

1.4.1 患者血液采集 入組患者來院檢查時，從檢驗科回收患者行血常規(guī)檢查后剩余的血液樣本，保存于-80 ℃冰箱中。

1.4.2 外周血DNA 的提取 應用Wizard?Genomic DNA 提取試劑盒進行提取。冷凍血充分解凍后混勻，取300 μL 加入到900 mL 細胞裂解液內，顛倒5～6 次混勻，室溫靜置10 min，顛倒2～3 次，14000×g 室溫離心30s，棄去上清液，保留10～20μL，渦旋振蕩器上充分振蕩15～20 s；加入300 μL 核酸裂解液，反復吹打5～6 次，液體變粘稠；加入100 μL蛋白沉淀液，14000×g 室溫離心3 min；在另一1.5 mL EP 管中加入異丙醇300 μL，將前一步驟中的上清液全部加入其中，輕柔反復顛倒至白色絮狀沉淀出現(xiàn)；14000×g 室溫離心1 min，棄去上清液，加入室溫70%乙醇300 μL，輕柔顛倒EP 管；再于14000×g 室溫離心1 min，棄去上清液，室溫靜置15 min；加入100 μL DNA 再水化液溶解DNA，標記后于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 PCR 實驗方法

（1）引物的設計：見表1。

（2）PCR 反應體系：25 μL 體系的配制為1 μL 模板、0.5μL 正向引物、0.5μL 反向引物、0.5μL 的10mM dNTP、2.5 μL Taq 緩沖液、0.2 μL 的5 U·μL-1Taq酶、20 μL 的水。

表1 引物的設計

（3）PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30～60 s；進行35 個循環(huán)；72 ℃修復延伸10 min。

1.4.4 基因型測序 用PCR 產物純化回收試劑盒對產物進行回收，并用測序儀對其序列進行測定（3730XL 美國ABI），得到序列峰圖進行分析。

1.5 統(tǒng)計分析方法

資料收集后經STATA14 進行卡方檢驗分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。計算各組基因型頻率及等位基因頻率，擬合優(yōu)度卡方檢驗、確認各組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。各組間基因型及等位基因頻率比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 研究患者的基本特征

入組的患者共109 人，分析中包含的受試者的臨床和人口學特征，見表2。

表2 納入研究患者的基本特征

2.2 等位基因頻率分析

探討了6 個基因共15 個SNP 位點，其中ATIC（rs2372536）中共有7 位患者未檢測出基因型；ATIC（rs7563206）中共有9 位患者未檢測出基因型。等位基因頻率見表3。

各等位基因頻率與中國漢族人群的等位基因頻率基本相同，無明顯差異。各基因型頻率分布均作Hardy-Weinberg 平衡檢驗，除RFC-1（rs1051266）、ABCB1 （rs1045642）、TYMS （rs2853542）、TYMS（rs34743033）、ATIC（rs7563206）這幾個基因型外，其他基因頻率分布P<0.05，表明樣本來自一個較大的群體，具有群體代表性。

2.3 等位基因與療效的相關性分析

探討了6 個基因共15 個SNP 位點，各基因型與療效的相關性檢驗見表4。

其中在ATIC（rs2372536）中共有7 位患者未檢測出基因型，即有效患者中5 位、無效患者中2 位；在ATIC（rs7563206）中共有9 位患者未檢測出基因型，即有效患者中8 位、無效患者中1 位。

2.3.1 RFC-1 基因多態(tài)性與療效的關系 RFC-1（rs1051266）的基因型分布（AA/AG/GG）在有效組和無效組的比較中未顯示統(tǒng)計學差異 （χ12=2.44，P1=0.12，χ22=1.16，P2=0.28，χ32=2.89，P3=0.09）。

2.3.2 ABCB1 基因多態(tài)性與療效的關系 ABCB1（rs1045642）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無效組的比較中未顯示統(tǒng)計學差異 （χ12=0.23，P1=0.63，χ22=0.01，P2=0.93，χ32=0.01，P3=0.93）。

2.3.3 MTHFR 基因多態(tài)性與療效的關系MTHFR（rs1801131）的基因型分布（AA/AC/CC）在有效組和無效組的比較中未顯示統(tǒng)計學差異 （χ12=0.001，P1=0.97，χ22=0.27，P2=0.60，χ32=0.27，P3=0.61）。MTHFR（rs1801133）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無效組的比較中未顯示統(tǒng)計學差異 （χ12=0.004，P1=0.95，χ22=0.07，P2=0.80，χ32=0.02，P3=0.89）。

2.3.4 TYMS 基因多態(tài)性與療效的關系 TYMS（rs2853542）的基因型分布（CC/CG/GG）在有效組和無效組比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=0.07，P1=0.79，χ22=1.56，P2=0.21，χ32=1.03，P3=0.31）。TYMS（rs34743033）的基因型分布（2R2R/2R3R/3R3R）在有效組和無效組比較中僅P1有統(tǒng)計學差異（χ12=5.69，P1=0.02），即含有三個重復序列的患者療效更好。

表3 患者MTX 代謝酶等位基因頻率

表4 MTX 代謝酶基因多態(tài)性與療效的相關性檢驗

2.3.5 ATIC 基因多態(tài)性與療效的關系 ATIC（rs2372536）的基因型分布（CC/CG/GG）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=0.57，P1=0.45，χ22=2.56，P2=0.11，χ32=2.69，P3=0.10）。ATIC（rs7563206）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異 （χ12=0.32，P1=0.57）。ATIC（rs12995526）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=1.41，P1=0.24，χ22=0.28，P2=0.60，χ32=0.33，P3=0.57）。ATIC（rs3821353）的基因型分布（GG/GT/TT）在有效組和無效組中無統(tǒng)計學差異（χ12=0.85，P1=0.36，χ22=1.00，P2=0.32，χ32=1.35，P3=0.24）。ATIC （rs16853834） 的基因型分布（CC/CT/TT） 在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=1.19，P1=0.28，χ22=0.27，P2=0.60，χ32=0.32，P3=0.57）。

2.3.6 DHFR 基因多態(tài)性與療效的關系 DHFR（rs408626）的基因型分布（AA/AG/GG）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=2.69，P1=0.10，χ22=1.84，P2=0.18，χ32=3.32，P3=0.07）。DHFR（rs12517451）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異 （χ12=0.26，P1=0.61，χ22=1.29，P2=0.26，χ32=1.23，P3=0.27）。DHFR（rs10072026）的基因型分布（TT/TC/C）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=3.85，P1=0.05）。DHFR（rs1643657）的基因型分布（AA/AG/GG）在有效組和無效組的比較中無統(tǒng)計學差異（χ12=2.00，P1=0.16）。

3 討論

早期預測RA 患者使用MTX 后的療效反應，以及制定MTX 個體化治療方案，以滿足RA 患者需求，這是目前臨床治療上亟須解決的問題。因此，本研究通過入組在本院診治并服用MTX 的109 名RA患者，考察了6 個MTX 代謝途徑的關鍵酶的15 個基因多態(tài)性位點，發(fā)現(xiàn)TYMS（rs34743033）含有3R重復序列的患者對治療反應效果好，即穩(wěn)定劑量的MTX 治療至少6 個月后ESR<20。

在本研究中發(fā)現(xiàn)TYMS （rs34743033） 與MTX療效的相關性，既往關于葡萄牙和塞爾維亞RA 患者的研究顯示，3R3R 基因型與MTX 治療的無反應相關[11，12]。而Stamp LK等[13]在對108 名美國RA 患者與MTX 療效之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)，2R2R 基因型患者療效較好。種族人群的基因差異導致的療效差異可能是導致研究結論不同的原因。

本研究中還涉及了RFC-1（rs1051266）、TYMS（rs34743033）、DHFR（rs408626，rs10072026）等位點基因多態(tài)性與MTX 療效的相關性；但是都未有顯著意義，有待進一步擴大樣本量來尋找療效差異的基因位點。

在國外研究方面，在對于RFC-1 的研究中，Drozdzik M 等[14]研究分析了174 名波蘭RA 患者與MTX（5～15 mg/周）療效之間的關系，提示AA 基因型患者臨床療效較好。Ghodke-puranik Y 等[9]研究分析了217 名印度RA 患者與MTX（20 mg/周）療效之間的關系，顯示含有A 等位基因的RA 患者療效更好。Hayashi H 等[15]研究分析了89 名日本RA 患者與MTX（8～12 mg/周）療效之間的關系，顯示具有G 等位基因的患者療效更差；Hashiguchi M 等[16]研究分析了99 名日本RA 患者與MTX 療效之間的關系，顯示含有AA 基因型患者療效更好。在服用MTX（4～10 mg/周）55 名日本RA 患者[17]與服用MTX（10～25 mg/周）327 名印度RA 患者[18]的研究提示，RFC-1 基因與療效無關。

ABC 轉運蛋白主要參與MTX 的外排，廣泛表達于腸道細胞、肝臟細胞、腎小管上皮細胞，排泌功能影響胞內MTX 水平。ABC 亞型ABCB1 的C3435T（rs1045642）多態(tài)性的研究，有的結果提示，與MTX 治療RA 的療效無關[19]，有的研究認為，TT基因型的患者病情緩解率較高[20]。

MTHFR 兩個突變位點C677T （rs1801133）和A1298C（rs1801131）是影響酶活性重要因素。既往，較多研究關注這兩個基因多態(tài)性與MTX 的療效的相關性，但是研究結果仍不一致。其中，關于C677T（rs1801133），分析了233 名服用MTX（2.5～25mg/周）的葡萄牙RA 患者[11]，200 名服用MTX（約15 mg/周）新西蘭RA 患者[13]，67 名巴基斯坦RA 患者[19]及309名英國RA 患者[21]，結果研究均表明，該位點與療效無關。而研究表明，120 名服用MTX （11.7±2.9 mg/周）的捷克RA 患者與MTX 療效之間的關系，CC 型和TT 型等位基因療效更好[22]。Dervieux T 等[23]研究分析了48 名美國RA 患者與MTX 療效之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)，TT 基因型患者療效較差。關于A1298C （rs1801131），217 名服用MTX 20 mg/周的印度RA 患者的研究顯示，含有A 等位基因的RA患者療效更好[9]。Kato T 等[17]分析了55 名日本服用MTX 4～10 mg/周的RA 患者與MTX 療效之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)，AA 基因更容易使疾病緩解。但是關于120 名服用MTX（11.7±2.9 mg/周）的捷克RA 患者的結果表明，CC 型等位基因療效更好[22]。

ATIC 是腺苷途徑的重要代謝酶，該基因突變會影響細胞外腺苷的釋放。309 名服用MTX（≥15 mg/周） 的英國患者的研究提示，ATIC 的三個單核苷酸（rs3821353，rs7563206 和rs16853834）與MTX 的療效相關[24]。關于ATIC（rs2372536）這個位點：108 名美國RA 患者與MTX 療效之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)，GG 基因型與患者的療效相關[13]。

關于DHFR 的研究，服用MTX （10.2±2.8 mg/周） 的125 名西班牙RA 患者的用藥顯示，AA 型患者療效較差[25]。

需要特別指出的是，目前有關代謝酶基因多態(tài)性與療效的研究結論并不一致，分析導致的原因可能主要為以下幾點：①目前相關的研究基本屬于回顧性或橫斷面研究。因此結果的分析僅為治療期間的一個時間點，并不能全面反映患者在整個治療期的情況，從而不能全面有效地反映出基因多態(tài)性這類潛在的遺傳標記物對MTX 療效的影響[26]。②MTX的療程、劑量和給藥途徑在各個研究之間有差異，也是造成各項研究結論差異的影響因素。一般亞洲人群的劑量為10 mg/周，而歐美人群高達15～20 mg/周。③各研究對疾病活動的評價標準有很大差異。不同研究對于入組患者疾病程度的標準和臨床觀察終點的標準并不完全一致。④不同種族人群存在基因背景的差異，也可能影響研究結果的判定。

基于以上影響因素以及本研究是單中心小樣本的研究，因此，后期一方面需要擴大樣本量和聯(lián)合多中心研究來探討中國人群基因多態(tài)性對MTX療效的影響；另一方面結合多位點的單倍型分析和MTX 活性產物的血藥濃度測定來更好地評價藥效，從而實現(xiàn)對RA 患者的個體化精準用藥，為患者合理、安全、經濟用藥提供保障。