3種氟苯尼考產(chǎn)品在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)及相對生物利用度研究

李朋朋　張珍　李林育　張聰　晏磊　李召斌　張曉東　姚路路　楊絨娟　高艷艷　周德剛

摘要? 為比較不同氟苯尼考產(chǎn)品在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)和相對生物利用度，將18頭健康豬隨機(jī)分成3組，按照20 mg/kg體重經(jīng)口給予受試制劑和參比制劑。采用高效液相色譜法測定血藥濃度，使用WinNonlin軟件計(jì)算主要藥動學(xué)參數(shù)，并計(jì)算3種產(chǎn)品的相對生物利用度。結(jié)果表明，普得康、市售國產(chǎn)產(chǎn)品和市售進(jìn)口產(chǎn)品的峰濃度（Cmax）分別為（13.46±1.26）、（13.68±2.55）和（13.33±1.02） μg/mL;達(dá)峰時(shí)間（Tmax）分別為（1.25±0.29）、（1.70±0.27）和（1.60±0.42）h;消除半衰期（t1/2β）分別為（3.77±0.21）、（4.06±0.41）和（3.75±0.21）h;藥時(shí)曲線下面積（AUC0-t）分別為（93.07±7.00）、（84.58±11.13）和（90.89±7.99） h·μg/mL。以市售國產(chǎn)和進(jìn)口產(chǎn)品作為對照藥物，普得康的相對生物利用度（F）分別為110.0%和102.4%。這表明普得康主要藥動學(xué)參數(shù)與2種市售產(chǎn)品相比無顯著差異，此結(jié)論為臨床合理使用該劑型提供了依據(jù)和指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞? 氟苯尼考;豬;藥代動力學(xué);生物利用度

中圖分類號? S859??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0125-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.038

Study on the Pharmacokinetics and Relative Bioavailability of Florfenicol in Pigs

LI Peng-peng，ZHANG Zhen，LI Lin-yu et al? （National Research Center for Veterinary Medicine，Luoyang，Henan 471003）

Abstract? To compare the pharmacokinetics and relative bioavailability of different florfenicol products in pigs，18 healthy pigs were randomly divided into three groups and given respectively a single dose of test preparation or reference preparations （20 mg//kg） by oral ad ministration.The plasma concentrations of florfenicol were measured by HPLC.The main pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin software，and the relative bioavailability of the three products was calculated.The results showed that the peak concentrations （Cmax） of Pudekang，commercially available domestic products，commercially available imported products were （13.46±1.26），（13.68±2.55） and （13.33±1.02） μg/mL respectively.Their peak time （Tmax） were （1.25±0.29），（1.70±0.27） and （1.60±0.42） h respectively.Their eli mination half-life（t1/2β） were （3.77±0.21），（4.06±0.41） and （3.75±0.21） h respectively.And their AUC0-t were （93.07±7.00），（84.58±11.13） and （90.89±7.99） h·μg/mL respectively.When two commercially available florfenicol products were used as reference preparations，the relative bioavailability （F） of test preparation（Pudekang）were 110.0% and 102.4% respectively.These results showed that there was no significant difference between main pharmacokinetic parameters of Pudekang and two commercially available florfenicol products.

Key words? Florfenicol;Pig;Pharmacokinetics;Bioavailability

作者簡介? 李朋朋（1986—），女，河南商丘人，獸醫(yī)師，碩士，從事新獸藥的開發(fā)與研究工作。*通信作者，高級獸醫(yī)師，從事新獸藥的開發(fā)與研究。

收稿日期? 2019-06-20

氟苯尼考（florfenicol）又稱氟甲砜霉素，由美國先靈葆雅公司于20世紀(jì)70年代末研制開發(fā)的動物專用酰胺醇類廣譜抗菌藥[1]。氟苯尼考的抗菌活性優(yōu)于氯霉素和甲砜霉素，主要作用于細(xì)菌70S核糖體的50S亞基，抑制肽鏈的形成，阻止了蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抗菌作用[2]。它對大部分革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均有效，大多用于敏感細(xì)菌所致的豬、雞及魚的細(xì)菌性疾病，尤其對呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效顯著。此外，氟苯尼考在動物體內(nèi)吸收良好、體內(nèi)分布廣泛， 無潛在的致再生障礙性貧血作用， 也無致畸、致癌和致突變作用的特點(diǎn)。目前，該藥己先后在日本、韓國、挪威、法國、英國、奧地利、墨西哥、西班牙、美國等國家注冊。我國于1990年批準(zhǔn)氟苯尼考上市，主要用于治療由敏感菌引起的豬、牛、雞和魚的細(xì)菌性疾病。為了增加氟苯尼考可溶性粉的在水中的溶解性，進(jìn)而提高其臨床使用效果，洛陽惠中獸藥有限公司對氟苯尼考可溶性粉進(jìn)行了工藝優(yōu)化，筆者根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[3]研究并比較了工藝優(yōu)化后產(chǎn)品與2種市售產(chǎn)品在豬體內(nèi)的藥動學(xué)特征，旨在為氟苯尼考的臨床用藥提供數(shù)據(jù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)動物

健康豬18頭，品種為杜洛克-大約克-長白豬雜交品種，60日齡左右，試驗(yàn)前臨床觀察7 d，按常規(guī)方法飼養(yǎng)，飼料為不含抗菌藥物的全價(jià)日糧，自由飲水和采食。給藥前12 h禁食，自由飲水，給藥2 h后自由飲水和采食。

1.2? 藥品與試劑

乙腈，色譜純，購自天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;乙酸乙酯，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國藥集團(tuán)分析純。

氟苯尼考對照品，100 mg/支，批號K0301703，由中國獸藥藥品監(jiān)察所生產(chǎn);

20%氟苯尼考粉（普得康），批號20180601，由洛陽惠中獸藥有限公司生產(chǎn); 20%氟苯尼考粉，市售某國產(chǎn)產(chǎn)品;2%氟苯尼考預(yù)混劑，市售某進(jìn)口產(chǎn)品。

1.3? 儀器

高效液相色譜儀，為美國Waters公司產(chǎn)品;電子分析天平，型號AB-265s，為梅特勒-托利多集團(tuán)公司產(chǎn)品;氮吹儀，型號HGC-RA，為天津恒奧科技有限公司產(chǎn)品;多管渦旋振蕩器，型號VX-Ⅲ，購自安簡（北京）科技有限公司;臺式高速冷凍離心機(jī)，型號3-16KL，為德國SIGMA產(chǎn)品; MiniSpin Plus離心機(jī)，購自Eppendorf（中國）有限公司。

1.4? 試驗(yàn)方法

1.4.1? 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制。①10 mg/mL氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確稱取氟苯尼考對照品101.32 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即為10 mg/mL的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃下保存。

②系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈水（乙腈∶水=3∶7）稀釋而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2? 血樣采集。

試驗(yàn)豬隨機(jī)分成3組，每組6頭，禁食12 h后分別按20 mg/kg劑量單次灌服20%普得康、20%氟苯尼考粉、2%氟苯尼考預(yù)混劑，給藥前用200 mL 1%羧甲基纖維素溶液將藥物制成混懸液。所有試驗(yàn)豬于給藥前及給藥后10、30 min及1、1.5、2、4、8、12、24 h自前腔靜脈采集血樣，每次采血5 mL置于抗凝管中，采集的血樣在2 h內(nèi)3 000 r/min離心10 min分離血漿，血漿分裝并標(biāo)記好后置于-20 ℃冰箱中保存，待測。

1.4.3? 樣品前處理。

參照劉帥帥等[4]的方法并稍作改進(jìn)。準(zhǔn)確吸取1 mL血漿置于15 mL離心管中，加入1 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，旋渦1 min，加入4 mL乙酸乙酯，旋渦10 min，4 400 r/min離心10 min，吸取有機(jī)相置于15 mL離心管中，重復(fù)提取1次，合并2次有機(jī)相，渦旋1 min，60 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL流動相復(fù)容，漩渦溶解，將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，11 000 r/min離心1 min，吸取上清液過0.22 μm 濾膜后進(jìn)行 HPLC 檢測。

1.4.4? 色譜條件。

色譜柱，Waters XBridge C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm;流速，1 mL/min;柱溫，30 ℃;進(jìn)樣量20 μL;檢測波長224 nm;流動相采用乙腈、水梯度洗脫，具體梯度洗脫程序見表1。

1.5? 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1? 檢測限和定量限。

按照“1.4.3”中方法處理空白血漿樣品得到空白基質(zhì)液，取0.9 mL空白基質(zhì)液添加0.1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣檢測，當(dāng)儀器信噪比（S/N）=3時(shí)，對應(yīng)的樣品中的含藥量即為檢測限;當(dāng)儀器信噪比（S/N）=10時(shí)，對應(yīng)的樣品中的含藥量即為定量限。

1.5.2? 回收率及精密度。

采用在空白血漿樣品中加標(biāo)準(zhǔn)工作液的方法進(jìn)行回收率和精密度的測定。取0.1 mL 200、50、1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別加入0.9 mL空白血漿中，渦旋混勻，得到含20、5、0.1 μg/mL（即高、中、低濃度）的血漿樣本溶液，然后按照“1.4.3”中方法進(jìn)行處理，每個濃度日內(nèi)測定3個平行，連續(xù)測定3 d，同時(shí)以處理后空白基質(zhì)液添加標(biāo)準(zhǔn)工作液作為各濃度的校準(zhǔn)濃度，以單點(diǎn)校準(zhǔn)方法計(jì)算質(zhì)控樣品中氟苯尼考的實(shí)測濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和相對回收率。

1.5.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍。按照“1.4.3”中所述方法處理空白血漿樣品得空白基質(zhì)液，取0.9 mL空白基質(zhì)液添加0.1 mL 1、5、10、50、100、200 μg/mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，得到0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做3個平行，進(jìn)樣檢測，利用平均峰面積與相應(yīng)濃度繪制線性回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.5.4? 數(shù)據(jù)處理。

利用WinNonlin非房室模型處理血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，然后使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件比較藥動學(xué)參數(shù)的差異，計(jì)算各藥物的相對生物利用度，分析受試藥物與參比藥物是否具有生物等效性。生物利用度的計(jì)算公式如下：

F=AUCt AUCs（1）

式中，AUCt為受試藥的藥時(shí)曲線下面積;AUCs為參比藥的時(shí)曲線下面積。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 方法檢測限及定量限

試驗(yàn)中空白血漿、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、空白添加樣品色譜圖見圖1。從圖1可以看出，氟苯尼考溶劑與血漿中其他基質(zhì)組分能完全分開，氟苯尼考的出峰時(shí)間在6.9 min左右。按照S/N=3為檢測限，S/N=10為定量限，經(jīng)測定該方法氟苯尼考在豬血漿中的檢測限為0.05 μg/mL，定量限為0.1 μg/mL。

2.2? 提取回收率及精密度驗(yàn)證

制備添加濃度分別為0.1、5、20 μg/mL的氟苯尼考血漿添加樣品，每個濃度做3個平行樣品，所得回收率及批內(nèi)、批間變異系數(shù)見表2。

《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》中規(guī)定低濃度日內(nèi)、日間RSD應(yīng)小于15%，在定量限附近的RSD應(yīng)小于20%。由表2可知，該方法變異系數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，因此該方法可用于后期樣品檢測。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

氟苯尼考在豬血漿中空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.1～20 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程分別為y=41 524x-1 549.3（R2=1）。由曲線方程及相關(guān)系數(shù)可知，在0.1～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以滿足檢測要求。

2.4? 血藥濃度數(shù)據(jù)與藥代動力學(xué)參數(shù)

豬灌胃給予3種氟苯尼考產(chǎn)品后，血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)見表3，利用藥代動力學(xué)軟件WinNonlin對血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)處理，所得藥代動力學(xué)參數(shù)匯總分別見表4。各給藥組豬的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

2.5? 生物利用度分析? 各藥物組中的藥動參數(shù)無顯著差異（P>0.05）。各組藥物生物利用度計(jì)算結(jié)果見表5。由表5可知，與氟苯尼考預(yù)混劑相比，氟苯尼考粉、普得康的相對生物利用度分別為93.06%和102.4%，普得康的相對生物利用度高于氟苯尼考粉。與氟苯尼考粉相比，普得康和氟苯尼考預(yù)混劑的相對生物利用度均大于100%。以上結(jié)果表明普得康在豬體內(nèi)的生物利用度較高，其吸收速度及程度與氟苯尼考粉、氟苯尼考預(yù)混劑產(chǎn)品相當(dāng)。

3? 討論與結(jié)論

國內(nèi)外對氟苯尼考在各種動物體內(nèi)進(jìn)行了藥物代謝動力學(xué)研究，如犬[5]、雞[6]、鴨[7]、兔[8]、羊[9]、牛[10]、豬[11-14]等。該研究中經(jīng)口給予試驗(yàn)豬普得康、氟苯尼考粉和氟苯尼考預(yù)混劑后，3種藥物的達(dá)峰時(shí)間（Tmax）分別為1.25、1.70和1.60 h，血藥峰濃度（Cmax）分別為13.46、13.68和13.33 μg/mL，消除半衰期（t1/2β）分別為3.77、4.06和3.75 h。與參比藥物氟苯尼考粉、氟苯尼考預(yù)混劑相比，受試藥物普得康的達(dá)峰時(shí)間較短，達(dá)峰濃度及消除半衰期介于兩參比藥物之間，但三者AUC、Tmax、Cmax等藥動學(xué)參數(shù)均無顯著差異（P>0.05）。該研究結(jié)果與萬進(jìn)等[2]的研究結(jié)果相一致，與劉帥帥等[4]報(bào)道的數(shù)據(jù)（Tmax=1.67 h、Cmax=24.68 μg/mL、t1/2β=10.22 h）、Liu等[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)（Tmax=1.35 h、Cmax=10.84 μg/mL、t1/2β=12.39 h）、Jiang等[12]報(bào)道的數(shù)據(jù)（Tmax=1.5 h、Cmax=9.9 μg/mL、t1/2β=10.0 h）相比，達(dá)峰時(shí)間均一致，但消除半衰期較短，說明該研究中3種藥物在豬體內(nèi)維持時(shí)間較短，消除較快。

受試藥物普得康與2種參比藥物相比，相對生物利用度高，分別為110.0%和102.4%，說明經(jīng)工藝改進(jìn)后的氟苯尼考可溶性粉在豬體內(nèi)的吸收速度及程度與參比藥物相一致，在臨床使用過程中可同等應(yīng)用。該試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然2種制劑的各藥動學(xué)參數(shù)無顯著差異，但也不安全相同，這可能是因?yàn)橹苿┕に嚥煌拢?種制劑的具體臨床效果仍需要進(jìn)行臨床試驗(yàn)，有待進(jìn)一步研究。

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