葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78及精漿生化與弱精子癥的相關(guān)性研究

韋玉霞　李潔　龐曉霞　廖碧云　陳興鴻　王俊利　陳學(xué)杰

【摘要】 目的 探究葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和精漿生化指標(biāo)（果糖和鋅）與弱精子癥的關(guān)系。

方法 選取80例弱精子癥不育男性為弱精子癥組，80名有生育史的健康男性為正常對(duì)照組，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、5-B-PASA顯色法、酶法檢測(cè)所有研究對(duì)象血清中的GRP78蛋白水平和精漿中的鋅及果糖等指標(biāo)，分析這三項(xiàng)指標(biāo)與男性弱精子癥的關(guān)系。

結(jié)果 弱精子癥患者組的血清GRP78蛋白的表達(dá)水平和精漿果糖表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而精漿中的鋅表達(dá)量在兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。輕度弱精子癥組（20%≤PR<32%）、中度弱精子癥組（10%≤PR<20%）和極重度弱精子癥組（PR<10%）的精漿果糖含量和血清GRP78蛋白表達(dá)量與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且精漿果糖和血清GRP78含量在正常對(duì)照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組有遞減趨勢(shì)。

結(jié)論 血清GRP78蛋白以及精漿果糖表達(dá)量的檢測(cè)有助于弱精子癥的臨床診斷，有可能作為弱精子癥嚴(yán)重程度評(píng)估的參考指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;果糖;鋅;弱精子癥

中圖分類號(hào)：R698+.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.11.003

Relationship between glucose regulatory protein 78 and seminal plasma biochemistry and male asthenospermia

WEI Yuxia1，4，LI Jie2，PANG Xiaoxia2，LIAO Biyun4，CHEN Xinghong4，WANG Junli4，CHEN Xuejie1

（1.Guangxi Medical University，Nanning 530001，China;2.Department of Laboratory Medicine of Xingyi Peolples Hostpital，Xingyi 562400，China;3.Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China;4.Reproductive Medicine Center，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】 Objective To explore the relationship between glucose regulatory protein 78（GRP78） and seminal plasma biochemical indicators（fructose and zinc） and asthenospermia.

Methods 80 infertile men with asthenospermia were selected as asthenospermia group and 80 healthy men with reproductive history as normal control group.ELISA，5-B-PASA and enzymatic methods were respectively used to detect the levels of serum GRP78 protein and the contents of zinc and fructose in seminal plasma for the relationship between indicators and male asthenospermia.

Results The expression level of GRP78 protein in serum and fructose in seminal plasma of asthenospermia patients was significantly lower than that of normal control group，and the difference was statistically significant（P<0.001），but no significant difference was observed in the expression of zinc in seminal plasma between the two groups（P>0.05）.Statistical difference（P<0.05） was also found in the expression of fructose in seminal plasma and GRP78 in serum of mild between normal group and asthenospermia group（32%>PR≥20%），moderate asthenospermia group（20%>PR≥10%） and severe asthenospermia group whose fructose expression in seminal plasma GRP78 in serum showed a tendency of decrease.

Conclusion The detection of GRP78 protein and fructose expression in seminal plasma is helpful for the clinical diagnosis of asthenospermia，and may be used to assess the severity of asthenospermia.

【Key words】 GRP78;fructose;zinc;asthenospermia

不孕不育癥已逐漸成為全球共同關(guān)注的健康問題，影響著全球15%～20%的育齡夫婦。這些不孕不育患者中男性因素引起的不育大約占50%，而獲得性和先天性精子異常是男性不育的重要因素[1]。作為精子質(zhì)量異常最常見的類型，弱精子癥是引起男性不育的主要因素之一。弱精子癥的特征是新鮮精液中的精子數(shù)量正常但精子活力降低，可能由泌尿生殖系統(tǒng)感染、精索靜脈曲張異常、精液液化、激素異常等原因引起。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是熱休克家族的成員。作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵伴侶蛋白，GRP78主要參與蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊，維持蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激原件的結(jié)合抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[2]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白的異常表達(dá)與多種生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3～5]。我國(guó)學(xué)者申樹林等[6]研究證實(shí)，GRP78蛋白在正常精子中高表達(dá)，而在弱精子中低表達(dá)。進(jìn)一步研究表明外源性GRP78作為分子伴侶，可能是通過調(diào)節(jié)精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平影響精子的運(yùn)動(dòng)。國(guó)外學(xué)者Visconti等[7]研究認(rèn)為蛋白質(zhì)磷酸化是精子獲能相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)重要條件之一，GRP78可能作為蛋白質(zhì)磷酸化激活因子通過CAMP信號(hào)途徑使精子獲能，認(rèn)為GRP78是維持精子活力的重要調(diào)節(jié)因子。在本研究中，我們將探討GRP78血清表達(dá)情況和精漿生化水平與弱精癥的相關(guān)性，以期為弱精子癥的診斷尋找新的診療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象選取

研究對(duì)象均來自2018年2～7月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心男科病人，以前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（PR%）<32%、其他精液常規(guī)參數(shù)正常的不育患者為弱精子癥患者組80例，其未采取避孕措施，婚后性生活正常，不育年限超過1年，排除女方因素。根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）精子活力分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以精子PR%為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)男性精子活力進(jìn)行分級(jí)，其中PR%≥32%為正常對(duì)照組，PR%<32%為弱精子癥組，再將弱精子癥患者按PR%大小分為輕度弱精子癥組（20%≤PR<32%）、中度弱精子癥組（10%≤PR<20%）和極重度弱精子癥組（PR<10%）。同時(shí)選取同一時(shí)期到我院生殖中心男科就診的80名已正常生育且精子前向運(yùn)動(dòng)百分率≥32%、精液常規(guī)檢查結(jié)果正常的健康男性為正常對(duì)照組。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 精液常規(guī)分析

所有研究對(duì)象禁欲3～7 d，通過手淫法采集全部精液于干凈的取精杯中，精確測(cè)量精液體積，置于37℃水浴孵育。液化后的精液使用西班牙SCA精液分析系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)精液分析，用Diff-Quik快速染色進(jìn)行鏡下精子形態(tài)分析。

1.2.2 精漿生化分析

將精液標(biāo)本經(jīng)離心速度為3000 rpm離心20 min，取上層精漿用于生化指標(biāo)的檢測(cè)。精漿中的鋅含量檢測(cè)采用5-B-PASA顯色法，果糖含量檢測(cè)采用酶法。試劑均來自深圳博銳德公司精漿生化系列檢測(cè)試劑盒。儀器使用美國(guó)Awareness公司ChemWell2910全自動(dòng)生化免疫分析儀。

1.2.3 GRP78蛋白的提取

靜脈抽取研究對(duì)象外周血3.0 mL，室溫自然凝固10～20 min，以離心速度為3000 rpm離心20 min，分離血清后分裝于干凈試管，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 GRP78蛋白含量的檢測(cè)

將置于-20℃的血清標(biāo)本置于室溫自然解凍，后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行GRP78蛋白的檢測(cè)。試劑盒為上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)，檢測(cè)儀器為RT-6000酶標(biāo)分析儀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組之間的比較采用成組t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。四組間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差齊性分析，均數(shù)間的多重比較采用SNK法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床特征

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，研究對(duì)象中弱精子癥組和正常對(duì)照組的平均年齡分別為（34.09±6.18）歲和（33.18±6.46）歲，兩組的精子濃度、精液量、精液pH值均在正常值范圍之內(nèi)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常對(duì)照組的精子前向運(yùn)動(dòng)百分率、非前向運(yùn)動(dòng)百分率高于弱精子癥組，不動(dòng)精子百分率低于弱精子癥組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表1。

2.2 精漿鋅、果糖、GRP78蛋白含量在弱精子癥組和對(duì)照組的比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，正常對(duì)照組的精漿果糖含量和血清GRP78蛋白水平表達(dá)量顯著高于弱精子癥組，且兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而弱精子癥患者精漿鋅含量與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 不同精子PR%組的精漿果糖、精漿Zn和血清GRP78水平比較

進(jìn)一步分析正常對(duì)照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組的精漿果糖、鋅和血清GRP78水平，并采用SNK法對(duì)組間進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組的精漿果糖含量和血清GRP78蛋白表達(dá)量均顯著高于輕度、中度和極重度弱精癥組（P<0.05）;而輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;精漿Zn含量在正常對(duì)照組與輕度、中度以及極重度弱精子癥組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。且精漿果糖和血清GRP78含量在正常對(duì)照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組有遞減趨勢(shì)，即隨著弱精子癥嚴(yán)重程度的增加其GRP78蛋白水平有不同程度的下降，如圖1所示。

3 討論

GRP78屬于熱休克蛋白70家族成員之一，作為一種分子伴侶在蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)過程及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究已證實(shí) GRP78在人和小鼠睪丸及附睪中精子發(fā)生時(shí)期表達(dá)[8～10]，且其表達(dá)異常可能與男性生殖系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)弱精子癥組的血清GRP78蛋白表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組，與申樹林等[6]研究結(jié)果相一致。為驗(yàn)證GRP78水平是否影響精子活力，本研究參照《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）標(biāo)準(zhǔn)，以精子PR%將研究對(duì)象分為四組（正常對(duì)照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組），并分析各組之間血清GRP78蛋白表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組的血清GRP78蛋白水平明顯高于輕度、中度、極重度弱精子癥組，提示血清GRP78水平可能與弱精子癥發(fā)病存在一定關(guān)系。此外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著弱精子癥嚴(yán)重程度上升，血清GRP78蛋白含量呈下降趨勢(shì)，進(jìn)一步表明該蛋白可能與精子活力高低有關(guān)，提示GRP78可能是維持精子活力的重要調(diào)節(jié)因子。目前，尚缺乏檢測(cè)GRP78蛋白水平的成熟方法。申樹林等[6]用雙向電泳凝膠分析法發(fā)現(xiàn)GRP78在正常精子蛋白中高表達(dá)、在弱精子癥蛋白中低表達(dá)，并采用Western-Blot法進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象，上述方法檢測(cè)較繁瑣，且成本較高。本研究參考GRP78在多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌和神經(jīng)精神系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的有關(guān)報(bào)道[11～13]，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清樣本GRP78 蛋白水平，該方法操作較簡(jiǎn)便且成本低于申樹林等的研究方法，因此，該方法可能適用于科學(xué)研究以及臨床應(yīng)用。

精漿是精子發(fā)育、成熟的內(nèi)環(huán)境，起著中和、緩沖、保護(hù)精子的作用。精漿中各生化指標(biāo)的變化會(huì)影響精子質(zhì)量和受精能力，因此，精漿生化檢查對(duì)評(píng)估男性生育的影響有重要意義。鋅是體內(nèi)合成多種酶的主要成分，與精子的發(fā)生、成熟、運(yùn)輸及在女性生殖道內(nèi)移動(dòng)和獲能密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)鋅含量缺乏時(shí)，合成睪丸素酶發(fā)生紊亂，造成精子活動(dòng)力下降;鋅還可以延緩精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，起到維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和通透性作用，從而保持精子活力[14]。關(guān)于精液參數(shù)與精漿鋅的相關(guān)性，一些研究者認(rèn)為精漿鋅水平與精子濃度、活力有關(guān)，如我國(guó)學(xué)者劉海儒等[15]研究發(fā)現(xiàn)精漿鋅含量與精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)和IVF受精率關(guān)系密切，精漿鋅含量是評(píng)估男性生殖力的重要指標(biāo)之一。然而，有研究者卻得出相反的結(jié)論，如張東梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)精漿鋅含量降低可導(dǎo)致精子密度下降，但對(duì)精子活力和形態(tài)沒有顯著影響。目前結(jié)論尚未統(tǒng)一。本研究結(jié)果顯示弱精子癥患者精漿鋅含量與對(duì)照組相比無顯著差異，可能是由于精漿鋅含量較低，其組間差異和相關(guān)性在小樣本檢測(cè)中不易被發(fā)現(xiàn)。精漿果糖由精囊腺分泌，是精子獲能的主要來源，精囊腺功能紊亂時(shí)，果糖含量降低，引起精子活動(dòng)力下降，導(dǎo)致弱精子癥。本研究分析表明，果糖含量降低時(shí)，精子活力亦下降，二者呈正相關(guān)。

近年來，在治療弱精子癥中常采用精子體外處理技術(shù)來提高精子的運(yùn)動(dòng)能力和穿透力。

本研究結(jié)果表明，GRP78蛋白表達(dá)水平可能是影響精子運(yùn)動(dòng)能力的一個(gè)重要因素。但本研究?jī)H間接揭示了GRP78水平與精子PR百分率的關(guān)系，尚未對(duì)GRP78影響精子PR百分率的具體機(jī)制進(jìn)行研究。此外，通過研究，發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白水平和精漿果糖水平與弱精子癥存在一定的相關(guān)性，表明GRP78與精漿生化聯(lián)合檢查對(duì)評(píng)估男性生育能力有一定的意義。但是有關(guān)GRP78 影響精子活動(dòng)力的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-09-23 修回日期：2019-10-28）

（編輯：潘明志）

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2018GXNSFAA050034）;廣西衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z20170234，Z20170236）;廣西教育廳高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2018KY0437）

作者簡(jiǎn)介：韋玉霞，女，主管技師，在讀碩士研究生，研究方向：生殖免疫。E-mail：359627186@qq.com

通信作者：陳學(xué)杰。E-mail：xuejiechen1970@126.com

[本文引用格式]韋玉霞，李潔，龐曉霞，等.葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78及精漿生化與弱精子癥的相關(guān)性研究[J].右江醫(yī)學(xué)，2019，47（11）：810-814.