米諾環(huán)素輔助治療對(duì)慢性牙周炎患者外周血T細(xì)胞亞群及PD-1、PD-L1表達(dá)的影響

吳江花　張虹麗　師靜蕊　李淑金

【摘要】 目的 探究米諾環(huán)素輔助治療對(duì)慢性牙周炎患者外周血T細(xì)胞亞群及程序性死亡分子-1（PD-1）、程序性死亡分子-1配體（PD-L1）表達(dá)的影響。

方法 選擇2014年10月～2016年10月接受治療的96例慢性牙周炎患者作為本次研究對(duì)象，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將其分為對(duì)照組和治療組，每組48例，對(duì)照組患者給予齦下刮治及根面平整治療，治療組患者在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上給予米諾環(huán)素進(jìn)行輔助治療，對(duì)比分析兩組患者以及治療組輕度、中度和重度患者外周血中CD4+、CD8+比例以及CD4+/CD8+、外周血CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞PD-1及PD-L1的表達(dá)。

結(jié)果 治療后3個(gè)月，外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯低于對(duì)照組，CD8+比例明顯高于對(duì)照組（P<0.001）;治療組輕度、中度和重度患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯降低，CD8+比例明顯升高（P<0.001）。治療后3個(gè)月，治療組患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1、PD-L1表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組（P<0.001）;治療組輕度、中度和重度患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1、PD-L1表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01或0.001）。

結(jié)論 米諾環(huán)素輔助治療可明顯降低慢性牙周炎患者外周血中CD4+比例，有效提升CD8+比例，并抑制PD-1和PD-L1的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 米諾環(huán)素;慢性牙周炎;T細(xì)胞亞群;程序性死亡分子-1;程序性死亡分子-1配體

中圖分類號(hào)：R781.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.11.006

Effect of Minocycline adjuvant therapy on levels of T Cell subsets in peripheral blood and expression of PD-1， PD-L1 of patients with chronic periodontitis

WU Jianghua1，ZHANG Hongli2，SHI Jingrui2，LI Shujin3

（1.Department of Periodontal Membrane，2.Department of Oral Medicine，3.Department of Oral Medicine，the Second Affiliated Hospital of Pingdingshan University and Stomatological Hospital of Pingdingshan，Pingdingshan 467000，China）

【Abstract】 Objective To explore the effect of minocycline adjuvant treapy on levels of T Cell subsets in peripheral blood and expression of programmed death-1（PD-1） and programmed death ligand-1（PD-L1） of patients with chronic periodontitis.

Methods 96 patients with chronic periodontitis treated in our hospital from October 2014 to October 2016 were randomized into control group and treatment group（48 each）.Control group was given root planning and subgingival scaling treatment whereas treatment group received the treatment of subgingival minocycline and root planning and subgingival scaling.Comparison was made in CD4+ and CD8+ levels in peripheral blood，the expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood CD4+ T lymphocytes and CD8+ T lymphocytes between two groups and among the mild，moderate and severe patients in treatment group.

Results 3 months after treatment，statistical difference was observed between two groups（P<0.001） with the CD4+ level and CD4+/CD8+ ratios in peripheral blood of treatment group being significantly lower whereas the CD8+ level in peripheral blood of treatment group being significantly higher than those of control group.The CD4+ level and CD4+/CD8+ ratios in peripheral blood of the mild，moderate or severe patients in treatment group decreased significantly，and the CD8+ level was significantly increased，and the difference was statistically significant（P<0.001）.3 months after treatment，the expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood CD4+ and CD8+ T lymphocytes of treatment group were significantly lower than those in control group and there was a statistical difference（P<0.001）.The expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood CD4+ and CD8+ T lymphocytes of the mild，moderate or severe patients in treatment group decreased significantly，and the difference was statistically significant（P<0.01 or 0.001）.

Conclusion Minocycline adjuvant treatment can significantly reduce the proportion of CD4+ in peripheral blood of patients with chronic periodontitis，improve the proportion of CD8+ and inhibit the expression of PD-1 and PD-L1.

【Key words】 minocycline;chronic periodontitis;T cell subset;programmed death-1;programmed death ligand-1

慢性牙周炎是一種口腔科常見慢性炎癥，主要特征為牙周組織破壞，臨床表現(xiàn)為牙周附著及牙槽骨逐步喪失，若未能及時(shí)給予有效治療，患者將出現(xiàn)牙齒逐步松動(dòng)，甚至脫落[1]。研究認(rèn)為牙周破壞主要與特定微生物感染和相關(guān)炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)，其病理學(xué)變化包括形成牙周袋、牙槽骨吸收和活動(dòng)性牙周病，臨床需根據(jù)患者具體牙周炎分型及分度確定具體治療方案[2]。目前，慢性牙周炎患者臨床主要治療方案為機(jī)械治療，如根面平整和齦下刮治等，目的為去除患者牙石和菌斑微生物。研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素對(duì)慢性牙周炎有一定療效，尤其是具有較深牙周袋的患者療效十分理想，通過在患者牙周袋中放置米諾環(huán)素，可獲得十分理想的輔助療效[3]。米諾環(huán)素作為四環(huán)素類的一種，具有廣譜抗菌效果，且具有極強(qiáng)的組織滲透性，能夠迅速發(fā)揮理想抑菌效果[4]。程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）與程序性死亡分子-1配體（programmed death ligand-1，PD-L1）信號(hào)通路，于近年被發(fā)現(xiàn)其與腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病以及慢性感染等密切相關(guān)[5]。PD-1和PD-L1主要在活化T淋巴細(xì)胞的表面進(jìn)行表達(dá)，慢性牙周炎發(fā)病過程中可能有PD-1/PD-L1信號(hào)通路的參與，PD-1和PD-L1表達(dá)量與牙周炎癥程度呈正相關(guān)[6]。T細(xì)胞亞群同慢性牙周炎炎癥反應(yīng)程度具有明顯相關(guān)性[7]。米諾環(huán)素雖然對(duì)慢性牙周炎具有明顯療效，但對(duì)患者外周血T細(xì)胞亞群及PD-1、PD-L1表達(dá)是否有影響尚未見報(bào)道。本研究主要通過探究米諾環(huán)素輔助治療對(duì)慢性牙周患者外周炎血T細(xì)胞亞群及PD-1、PD-L1表達(dá)的影響，以期為慢性牙周炎患者臨床治療提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年10月～2016年10月在我院口腔科接受治療的96例慢性牙周炎患者，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將其分為對(duì)照組和治療組，每組48例。其中治療組患者細(xì)分為輕度、中度和重度三個(gè)亞組，根據(jù)患者附著喪失（clinical attachment loss，CAL）情況及牙齒缺失數(shù)目進(jìn)行劃分[8]，輕度：患者牙齒缺失數(shù)目不超過3顆，不具有任何位點(diǎn)CAL超過3 mm，全口牙CAL均值在0.6～1.5 mm;中度：患者牙齒缺失數(shù)目不超過5顆，CAL超過3 mm的鄰面位點(diǎn)數(shù)低于8個(gè)，分布在6顆牙或3個(gè)區(qū)以上，全口牙CAL均值在1.6～2.4 mm;重度：患者牙齒缺失數(shù)目不超過14顆，不低于3個(gè)區(qū)存在鄰面位點(diǎn)CAL超過5 mm，全口牙CAL均值在2.5 mm以上。其中輕度患者22例，中度患者16例，重度患者10例。各組患者性別、年齡和病程等一般資料對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。本研究方案已通過本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者及其家屬均詳細(xì)了解本研究方案，且自愿簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合慢性牙周炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②入組前3個(gè)月內(nèi)無免疫調(diào)節(jié)劑、非甾體類以及抗生素治療史的患者;③口腔內(nèi)具有大于18顆牙齒數(shù)，且健康牙齒（無修復(fù)體、不良充填體、齲病等）數(shù)目不得少于4顆的患者;④牙周探診深度大于4 mm的患牙數(shù)目不低于2顆;⑤根尖X線檢查表明牙頸部不具有任何牙體病變;⑥入組前半年內(nèi)未接受過任何牙周治療的患者;⑦肝腎功能、心肺功能以及心電圖檢查均顯示正常的患者。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有智力障礙或具有精神病史的患者;②伴有血液病、糖尿病、自身免疫性疾病等嚴(yán)重系統(tǒng)疾病的患者;③超過10顆牙齒有牙槽骨吸收和牙齒明顯松動(dòng)的重度牙周炎患者;④牙髓炎、急性牙周炎或侵襲性牙周炎患者;⑤不能按照要求戒煙、戒酒的患者;⑥處于妊娠期或哺乳期的婦女;⑦有抗生素過敏史的患者。

1.3 治療方法

對(duì)照組通過齦下刮治及根面平整對(duì)患者進(jìn)行治療。首先醫(yī)生需密切觀察各患者牙周炎范圍和嚴(yán)重程度，以及牙周袋等具體情況;治療前對(duì)患者進(jìn)行局部麻醉，通過超聲波潔牙機(jī)（Cavitron Bobcat Pro，購自上海晚成醫(yī)療器械有限公司）配合齦下刮治器（豪孚迪 Gracey，購自上?？蒂I醫(yī)療科技有限公司）對(duì)患者右上象限牙齒給予細(xì)致齦下刮治，將牙石和菌斑完全刮除，每顆牙齒至少進(jìn)行10 min的齦下刮治，并對(duì)患牙各個(gè)象限給予相同工作[10]。然后對(duì)軟化牙骨質(zhì)層進(jìn)行繼續(xù)刮除，并給予根面平整。在患者齦下刮治及根面平整操作結(jié)束后，需仔細(xì)清洗患者牙周袋，最大程度清理干凈機(jī)械操作殘留的牙石碎片、肉芽組織及病原菌[11]。治療組在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上給予鹽酸米諾環(huán)素軟膏（派麗奧，批準(zhǔn)文號(hào)：注冊證號(hào)H20100244，生產(chǎn)廠家：SunstarINCJapan）進(jìn)行輔助治療。采用與對(duì)照組同樣的操作方法進(jìn)行齦下刮治及根面平整，在上述操作完成并進(jìn)行最大程度清理后，將米諾環(huán)素軟膏緩慢注入患者牙周袋底部，米諾環(huán)素軟膏注射過程中，需對(duì)注射部位進(jìn)行調(diào)整，邊注射邊后退，將藥物注射于最佳位置[12]，以牙齦邊緣可見藥物為適。

1.4 觀察指標(biāo)

外周血T淋巴細(xì)胞亞群及表面PD-1、PD-L1的表達(dá)：采集每位患者治療前和治療后3個(gè)月時(shí)清晨空腹靜脈血5 mL，并置于還有肝素鈉抗凝的滅菌試管內(nèi)，詳細(xì)標(biāo)注各患者基本信息，于6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測。取含有肝素鈉抗凝的全血100 μL分別放入三支試管中，各加入抗體10 μL，其中第一支試管內(nèi)加入PE-PD-1、PE-Cy5-CD4和FITC-CD8;第二支試管內(nèi)加入PD-L1抗體（PE-PD-L1）、流式細(xì)胞抗體藻紅蛋白-Cy5-CD4（PE-Cy5-CD4）和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD8抗體（FITC-CD8）;第三支試管內(nèi)加入PE-IgG1、PE-Cy5-IgG1和FITC-IgG1。三支試管均在避光室溫條件下孵育半小時(shí)，然后加入2 mL細(xì)胞裂解液，在紅細(xì)胞裂解后再加入PBS進(jìn)行2次離心洗滌，并通過PBS重懸，然后通過流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特 FC 500 MCL/MPL，購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）進(jìn)行檢測[13];CD4+、CD8+水平和CD4+/CD8+比例同樣通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定，采用雙色直標(biāo)免疫熒光法檢測，試劑盒均購自武漢博士生物有限公司，具體檢測方法操作步驟均嚴(yán)格參照使用說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以百分?jǐn)?shù)（%）表示計(jì)數(shù)資料，組間對(duì)比分析采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行;計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后外周血T細(xì)胞亞群變化情況

治療后3個(gè)月，兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯降低，CD8+比例均明顯升高，與治療前相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;此外，治療組患者治療后3個(gè)月，外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯低于對(duì)照組，CD8+比例均明顯高于對(duì)照組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表2。

2.2 治療組中三個(gè)亞組患者治療前后外周血T細(xì)胞亞群變化

治療前，輕度、中度和重度患者隨著病情的加重，外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+明顯升高，CD8+比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。米諾環(huán)素輔助治療后，輕度、中度和重度患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯降低，CD8+比例均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

2.3 兩組患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞PD-1和PD-L1表達(dá)情況

治療后3個(gè)月，兩組患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平均明顯降低，與治療前相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;此外，治療組患者治療后3個(gè)月，外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表4。

2.4 治療組中三個(gè)亞組患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞PD-1和PD-L1表達(dá)

治療前輕度、中度和重度患者隨著病情的加重，外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且治療后，輕度、中度和重度患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或0.001）;各亞組患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

3 討論

大部分慢性牙周炎患者有牙齦出血癥狀，炎癥進(jìn)一步加重將導(dǎo)致牙齦腫脹、附著消失及牙齒出現(xiàn)不同程度松動(dòng)等[14]。齦下刮治與根面平整治療主要通過機(jī)械作用將牙周袋牙石及菌斑去除，其本質(zhì)為深層清潔牙骨質(zhì)，兩者通常共同進(jìn)行，為臨床輕度或中度牙周炎患者主要治療措施[15]。

米諾環(huán)素具有極強(qiáng)的組織滲透性，可迅速發(fā)揮有效抑菌作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌具有極強(qiáng)抑菌效果，米諾環(huán)素還具有牙本質(zhì)小管開放作用，這有利于受病原菌侵蝕的牙骨質(zhì)再生[3，16]。米諾環(huán)素有可能會(huì)引起多方面不良反應(yīng)，但本研究因采用局部給藥，副作用輕微，極少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)牙齦局部紅腫等過敏反應(yīng)，表現(xiàn)十分輕微，停用后很快自然消退。

CD4+為輔助性T細(xì)胞，CD8+為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，CD4+/CD8+比例關(guān)系為免疫調(diào)控的一個(gè)重要樞紐，在慢性牙周炎患者中，其外周血CD4+ T淋巴細(xì)胞比例顯著升高，而CD8+ T淋巴細(xì)胞比例將明顯降低[17]。本研究結(jié)果表明，治療組患者治療后3個(gè)月，外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯低于對(duì)照組，CD8+比例均明顯高于對(duì)照組，米諾環(huán)素輔助治療后，治療組中，輕度、中度和重度患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明顯降低，且CD8+比例均明顯升高?？梢?，米諾環(huán)素不僅能夠有效抑制慢性牙周炎患者牙周組織炎癥反應(yīng)，對(duì)患者免疫功能恢復(fù)亦具有一定促進(jìn)作用。

PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的負(fù)性共刺激信號(hào)分子受體，其與配體PD-L1相結(jié)合后，能夠抑制機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞增殖，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答作用，在腫瘤免疫逃逸及慢性感染等的免疫反應(yīng)介導(dǎo)過程中具有十分重要的作用[17]。近年來，有學(xué)者提出，最終造成慢性牙周炎牙周組織破壞的關(guān)鍵因素是機(jī)體對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答[18]。Th1和Th2平衡對(duì)慢性牙周炎發(fā)生具有重要影響，而PD-1/PD-L1信號(hào)途徑可能會(huì)對(duì)Th1和Th2的平衡產(chǎn)生一定影響，從而抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病慢性遷延[19]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎發(fā)生過程中OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路的參與，PD-1/PD-L1可能對(duì)上述信號(hào)途徑產(chǎn)生影響，從而對(duì)慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組患者治療后3個(gè)月，外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，提示米諾環(huán)素輔助治療不僅顯著降低患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+比例，有效提升CD8+比例，而且可抑制PD-1和PD-L1的表達(dá)。

綜上所述，米諾環(huán)素輔助治療在慢性牙周炎臨床治療中具有重要價(jià)值。但本研究還存在一定局限性，如研究時(shí)間過短、研究對(duì)象數(shù)量較少，未對(duì)PD-1、PD-L1在慢性牙周炎患者中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制做深入探究等。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-06-20 修回日期：2019-09-24）

（編輯：王琳葵 梁明佩）

作者簡介：吳江花，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，研究方向：牙周炎疾病。E-mail：jun2009525@163.com

[本文引用格式]吳江花，張虹麗，師靜蕊，等.米諾環(huán)素輔助治療對(duì)慢性牙周炎患者外周血T細(xì)胞亞群及PD-1、PD-L1表達(dá)的影響[J].右江醫(yī)學(xué)，2019，47（11）：826-832.