液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定罌粟殼中5種生物堿的含量

黃寧，唐麗君，黃恩堂，蘇星，王毅梅，楊希

1.鷹潭市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 鷹潭 335000；2.江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330001

罌粟殼為罌粟科植物罌粟的干燥成熟果殼，具有斂肺、澀腸、止痛的功效，用于久咳，久瀉，脫肛，脘腹疼痛。收錄在《中國藥典》2015年版一部(以下簡稱藥典)，但本品易成癮[1]，需嚴(yán)格控制用量，所以罌粟殼的定量檢測(cè)顯得尤為重要。罌粟殼的活性成分主要是嗎啡、罌粟堿、可待因、那可丁、蒂巴因等生物堿，目前大多研究性文獻(xiàn)［2-20］研究罌粟殼成分主要從以上5種生物堿中選擇1～5種作為分析對(duì)象，不同產(chǎn)地、批號(hào)的罌粟殼中生物堿的含量差異較大。藥典中罌粟殼的【含量測(cè)定】項(xiàng)目僅對(duì)嗎啡進(jìn)行了控制。

筆者通過大量試驗(yàn)，建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定罌粟殼中嗎啡、罌粟堿、可待因、那可丁、蒂巴因的含量。該方法高效快捷，分離效果好，定量準(zhǔn)確穩(wěn)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜)LC/MS QQQ(配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、ESI電噴霧離子源，美國Agilent Technologies 1290 InfinityⅡ/6460 Triple Quad LC/MS)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器上海有限公司MSE125P-1CE-DU)

1.2 材料罌粟殼藥材來源于甘肅農(nóng)墾醫(yī)藥藥材有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170304、20171210、20 171213；對(duì)照品來源見表1。

三氯甲烷、濃氨、醋酸、正丁醇、乙酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。過濾用0.22μm濾膜。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(規(guī)格為2.1×100mm，5μm)，以乙腈-0.1%甲酸水(7:3)為流動(dòng)相，流速0.4mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5μL。

2.2 質(zhì)譜條件ESI離子源干燥氣溫度300℃，干燥氣流速11 L/min，毛細(xì)管電壓4000V，正掃描模式，MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密稱取嗎啡、可待因、那可汀、蒂巴因、罌粟堿對(duì)照品，用甲醇稀釋至約250μg/mL的溶液，嗎啡、可待因用乙腈稀釋成系列濃度25、50、100、150、250ng/mL，罌粟堿、那可汀、蒂巴因用乙腈稀釋成系列濃度5、10、20、30、50ng/mL，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各5μL，注入液-質(zhì)聯(lián)用儀分析，記錄色譜質(zhì)譜圖，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，罌粟殼生物堿濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，分別線性回歸分析。

2.4 供試品溶液的制備取樣品粉末(過三號(hào)篩)約1g，精密稱定，置250mL具塞錐形瓶中，精密加入50mL含5%醋酸的20%甲醇溶液，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率20kHz)30min，取出，放冷，再稱定重量，用含5%醋酸的20%甲醇溶液，補(bǔ)足減失重量，搖勻，靜置，吸取上清液濾過，即得。

2.5 測(cè)定法分別精密吸取供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各5μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄色譜質(zhì)譜圖。

表1 對(duì)照品來源

表2 各種化合物質(zhì)譜條件

2.6 結(jié)果計(jì)算公式：X (%)=(ρ×V×n×100×10-9/m)%

X——試樣中待測(cè)組分的含量，單位為%；

ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中待測(cè)組分的含量，單位為ng/mL；

V——試樣的體積，單位為mL；

m——試樣的質(zhì)量，單位為g；

n——樣品稀釋倍數(shù)。

2.7 線性關(guān)系考察如圖5所示，按2.3制備好標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀回歸方程分別為y=4.607561x+136.665908、y=27.198157x+476.925291、y=508.526038x+286.535574、y=81.784540x+181.455263、y=241.356278x+717.213296，相關(guān)系數(shù)r分別為0.99597、0.99686、0.99998、0.99905、0.99762，各生物堿在線性范圍內(nèi)的濃度與峰面積均呈良好線性關(guān)系，嗎啡、可待因的線性范圍是25～250ng/mL，罌粟堿、蒂巴因、那可汀的線性范圍是5～50ng/mL。

圖1 嗎啡標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

圖2 可待因標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

圖3 罌粟堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程

圖4 蒂巴因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程

圖5 那可汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程

2.8 定量限將已知低濃度的罌粟殼生物堿對(duì)照品溶液，按方法測(cè)定，以信噪比(S/N)約為10:1時(shí)相應(yīng)濃度確定為定量限(LOQ)，嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀的定量限分別為2.4×10-2mg/kg、2.4×10-2mg/kg、6×10-4mg/kg、6×10-4mg/kg、6×10-4mg/kg。

2.9 精密度將混合標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，精密度用峰面積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因和那可汀的峰面積的RSD值分別為1.32%、4.63%、1.11%、0.56%、1.77%，RSD均小于5%，表明精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)在室溫條件下，將同一份樣品溶液每隔幾小時(shí)(0h、2 h、4 h、8 h、12 h)測(cè)定一次，計(jì)算嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀峰面積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，分別為3.38%、1.38%、4.44%、4.99%、3.60%。說明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.11 回收率試驗(yàn)分別精密稱取相同質(zhì)量的樣品10份，一份不加標(biāo)準(zhǔn)品，作為測(cè)定本底值的樣品。另外9份分別加入高、中、低三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制備供試液，每種濃度重復(fù)3次，按方法測(cè)定，計(jì)算其樣品加標(biāo)回收率，嗎啡的平均加標(biāo)回收率是78.28%～103.62%，可待因的平均加標(biāo)回收率是80.86%～108.80%，罌粟堿的平均加標(biāo)回收率是84.21%～101.61%，蒂巴因的平均加標(biāo)回收率是74.63%～96.40%，那可汀的平均加標(biāo)回收率是76.26%～91.08%。表明本法準(zhǔn)確度良好。

2.12 樣品測(cè)定取3批罌粟殼樣品(批號(hào)：20170304、20171210、20171213)，按本法測(cè)定，結(jié)果含量見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 試驗(yàn)條件的選擇

3.1 提取溶劑的選擇試驗(yàn)分別用水、甲醇、含5%醋酸的20%甲醇、70%乙醇、水飽和的正丁醇(濃氨調(diào)pH值至11)、三氯甲烷(用濃氨調(diào)pH值至9)做為溶劑提取罌粟殼生物堿，實(shí)驗(yàn)表明各種溶劑提取5種生物堿的效果各有優(yōu)劣，綜合考慮5種生物堿的提取效果以及響應(yīng)值、檢出限和線性范圍，最后確定用含5%醋酸的20%甲醇作為提取溶劑。

3.2 流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)嘗試多種流動(dòng)相：甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀+0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液、以乙腈-0.1%甲酸水(7:3)為流動(dòng)相、乙腈-0.01mol/L乙酸銨溶液(pH3.0、3.5、3.8、4.0、4.3)，試驗(yàn)表明以乙腈-0.1%甲酸水(7:3)為流動(dòng)相洗脫分離效果最好，如圖6～10所示。

3.3 柱溫的選擇分別在30℃、35℃、40℃柱溫下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果在柱溫40℃時(shí)峰分離度和峰型最好，如圖6～10所示。

圖6 嗎啡質(zhì)譜圖

圖7 可待因質(zhì)譜圖

圖8 罌粟堿質(zhì)譜圖

圖9 蒂巴因質(zhì)譜圖

圖10 那可汀質(zhì)譜圖

4 討論

藥典中嗎啡的含量限度為0.06%～0.40%[1]，由于罌粟殼是管制藥品，想獲得多批次的藥材比較困難，需要進(jìn)一步對(duì)不同產(chǎn)地、不同批次的罌粟殼藥材進(jìn)行多次試驗(yàn)，方可確定含量限度范圍。