紫草素對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎的保護(hù)作用及其對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響①

郭向輝 吳雅坤

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院急診科，唐山 063000)

重癥急性胰腺炎并發(fā)癥多、死亡率高，其發(fā)病機(jī)制和炎性細(xì)胞因子、胰酶活性、細(xì)胞凋亡因子失訪、微循環(huán)障礙等多種因素關(guān)系密切。當(dāng)胰腺內(nèi)消化酶被異?；罨瘯r(shí)可發(fā)生重癥急性胰腺炎，重癥急性胰腺炎發(fā)作時(shí)胰蛋白酶和溶酶體酶接觸而被激活，激活的胰蛋白酶導(dǎo)致胰蛋白酶原分子活化，消化酶的活化導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子分泌，引起胰腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、血管損傷、水腫、細(xì)胞死亡等[1]。重癥急性胰腺炎受損的胰腺組織釋放大量炎性介質(zhì)可引起肝損傷、肺損傷等并發(fā)癥的發(fā)生[2]。紫草素是一種從紫草中提取的萘醌類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性，對(duì)重癥急性胰腺炎具有保護(hù)作用[3]，但其作用機(jī)制尚不清楚。TLR4/NF-κB在重癥急性胰腺炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，該通路激活可調(diào)控炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而參與炎癥反應(yīng)[4]。本文就紫草素對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎的保護(hù)作用及其對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討紫草素保護(hù)大鼠重癥急性胰腺炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體質(zhì)量380～410 g、雌雄各半、Wistar大鼠100只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0001。主要試劑：紫草素(成都德思特公司，批號(hào)：DST170210-036)，HE染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，兔抗鼠IL-6單克隆抗體、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體、兔抗鼠NF-κBp65單克隆抗體、兔抗鼠IκB-α單克隆抗體等抗體(英國(guó)Abcam公司)等。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將100只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組，模型組，紫草素1組和紫草素2組，每組25只。

1.2.2建立重癥急性胰腺炎模型及處理 將模型組、紫草素1組和紫草素2組大鼠禁食12 h，平臥固定到手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒、鋪巾，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取上腹部正中切口，暴露胰腺頭部，辨認(rèn)十二指腸乳頭，在十二指腸乳頭旁用留置針穿破腸壁，沿乳頭方向探入胰膽管并推入1.5 cm，微血管鑷加管固定，并同時(shí)用微血管鑷夾閉肝總管。以0.1 ml/min 的速度推注3.5%牛磺脫氧膽酸鈉0.1 ml/100 g，觀察大鼠胰腺情況，胰腺出現(xiàn)種植、皂化斑形成、點(diǎn)狀出血、壞死等改變?yōu)樵炷３晒Γ粚?duì)照組大鼠僅開(kāi)腹，并翻動(dòng)胰腺數(shù)次，關(guān)腹。紫草素1組和紫草素2組于術(shù)前1 d分別給予紫草素1 mg/kg和2 mg/kg腹腔注射，每日1次[5]；對(duì)照組和模型組注射等量生理鹽水。

1.2.3標(biāo)本采集 建模后24 h，各組取10只大鼠，抽取眼眶血用于測(cè)定血脂肪酶和淀粉酶水平；稱(chēng)取大鼠體重，斷頸處死大鼠后取胰腺組織，稱(chēng)取胰腺重量，計(jì)算胰腺重量指數(shù)=胰腺重量/大鼠體重×100%，取胰腺組織用于Western blot檢測(cè)。每組取10只大鼠，斷頸處死后取胰腺組織，于福爾馬林中固定、石蠟包埋，用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.4ELISA測(cè)定血清脂肪酶、淀粉酶水平 將各組大鼠眶靜脈血3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法測(cè)定血清脂肪酶和淀粉酶水平。

1.2.5伊紅-蘇木素(HE)染色測(cè)定胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化 將各組小鼠胰腺石蠟組織切成后5 μm 厚切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下拍照并觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化。按照改良Kusske評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行胰腺病理評(píng)分：無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、水腫、壞死為0分；壞死面積1%～10%，出血、水腫0～25%為1分；壞死面積11%～20%，出血、水腫25%～50%為2分；壞死面積21%～30%，出血、水腫50%～75%為3分；壞死面積>30%，出血、水腫>75%為4分。5個(gè)炎細(xì)胞為0.5分，>30個(gè)炎細(xì)胞為4分。胰腺病理評(píng)分為壞死得分+出血得分+水腫得分+炎癥得分。

1.2.6Western blot測(cè)定胰腺組織中IL-6、TNF-α、NF-κBp65和IκB-α蛋白水平 將胰腺組織勻漿，提取胰腺組織總蛋白，采用BCA測(cè)定胰腺組織蛋白濃度及含量，每孔上樣20 μg，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗：兔抗鼠IL-6單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠NF-κBp65單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠IκB-α單克隆抗體(1∶1 000)過(guò)夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗孵育1 h，加入顯色液顯色，采用Quantity One軟件分析各蛋白條帶亮度，胰腺組織中IL-6、TNF-α、NF-κBp65和IκB-α蛋白水平以IL-6、TNF-α、NF-κBp65和IκB-α蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.7免疫組化法測(cè)定胰腺組織中NF-κBp65蛋白表達(dá) 將石蠟包埋胰腺組織切片脫蠟，與過(guò)氧化氫孵育10 min，放入檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)10 min，加入山羊血清封閉30 min，加入一抗：兔抗鼠IκB-α單克隆抗體(1∶200)過(guò)夜孵育，加入二抗孵育1 h，陰性對(duì)照用PBS代替，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。采用Image-Pro-plus6.0圖像分析軟件計(jì)算NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率(NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠胰腺重量指數(shù)和血脂肪酶、淀粉酶水平比較

2.2各組大鼠胰腺組織HE染色比較 對(duì)照組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)未見(jiàn)明顯異常，模型組大鼠胰腺組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死等損傷明顯，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死明顯減輕，且紫草素2組病理?yè)p傷較紫草素1組輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of pancreatic tissue in rats of each group(×400)

與對(duì)照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺病理?yè)p傷指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺病理?yè)p傷指數(shù)降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺病理?yè)p傷指數(shù)降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胰腺病理?yè)p傷指數(shù)比較

2.3各組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3和圖2。

表3 各組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白水平比較

圖2 各組大鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot of IL-6 and TNF-α protein in pancreatic tissue of rats of each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Shikonin 1 group;4.Shikonin 2 group.

2.4各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65和IκB-α蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平升高(P<0.05)，IκB-α蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平降低(P<0.05)，IκB-α蛋白水平升高(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平降低(P<0.05)，IκB-α蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖3。

表4 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65和IκB-α蛋白水平比較

圖3 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65和IκB-α蛋白Western blot電泳圖Fig.3 Western blot of NF-κBp65 and IκB-α protein in pancreatic tissue of rats of each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Shikonin 1 group;4.Shikonin 2 group.

2.5各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，模型組、紫草素1組、紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率升高(P<0.05)；與模型組比較，紫草素1組和紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率降低(P<0.05)；與紫草素1組比較，紫草素2組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4和表5。

圖4 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65蛋白免疫組化染色(×400)Fig.4 Immunohistochemical staining of NF-κBp65 protein in pancreatic tissue of rats in each group(×400)

表5 各組大鼠胰腺組織中NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率比較

3 討論

重癥急性胰腺炎主要表現(xiàn)為胰腺的出血和壞死，因常繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙等，故重癥急性胰腺炎的死亡率比較高[7]。目前治療重癥急性胰腺炎的藥物要么效果不理想，要么并發(fā)癥比較多，因此尋找治療重癥急性胰腺炎的新的藥物具有重要意義。 紫草為紫草科植物，藥用價(jià)值比較高，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝等多種生物活性，在多種疾病的治療中具有顯著療效[8]。紫草素是紫草的一種有效提取物，具有顯著的抑制炎癥反應(yīng)的作用，在關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷、局部腦缺血等疾病中抗炎效果顯著[9,10]。紫草素對(duì)重癥急性胰腺炎的胰腺組織、肺組織、腎組織均有保護(hù)作用[5,11,12]。本文對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠給予紫草素治療，發(fā)現(xiàn)紫草素可降低重癥急性胰腺炎大鼠的胰腺重量指數(shù)、血脂肪酶和淀粉酶水平、胰腺病理?yè)p傷指數(shù)，高劑量紫草素對(duì)胰腺的保護(hù)作用較低劑量紫草素顯著。表明紫草素對(duì)重癥急性胰腺炎具有保護(hù)作用，分析紫草素具有顯著的抑制炎癥反應(yīng)的作用，其可能通過(guò)顯著的抑制炎癥反應(yīng)對(duì)重癥急性胰腺炎發(fā)揮保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)在重癥急性胰腺炎的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，IL-6和TNF-α是重癥急性胰腺炎研究中關(guān)注最多的炎癥細(xì)胞因子。IL-6在機(jī)體抗免疫反應(yīng)中具有重要作用，有巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生[13,14]；TNF-α為炎癥始動(dòng)因子，介導(dǎo)IL-6等多種炎癥細(xì)胞因子的釋放，并可激活一氧化氮和氧自由基的生成，促進(jìn)白細(xì)胞趨化和黏附[15]，從而損傷胰腺組織。TLR4/NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16，17]，TLR4在胰腺細(xì)胞表面廣泛分布，當(dāng)胰腺受到損傷、感染、缺血等刺激時(shí)被激活，激活的TLR4可激活NF-κB，并激活MYD88，然后降解NF-κB上游的IκB，使p65進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)重癥急性胰腺炎的發(fā)生和TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活關(guān)系密切，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)重癥急性胰腺炎具有保護(hù)作用[19]。紫草素抗炎作用的機(jī)制和TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用，如紫草素通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路保護(hù)大鼠脊髓損傷[20]；紫草素通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路預(yù)防D-半乳糖胺和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷[21]；紫草素通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路保護(hù)實(shí)驗(yàn)性缺血性腦卒中[22]。因此推測(cè)紫草素可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)重癥急性胰腺炎的作用，本文對(duì)此進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)：紫草素降低重癥急性胰腺炎大鼠胰腺重量指數(shù)、血脂肪酶和淀粉酶水平、胰腺病理?yè)p傷指數(shù)、胰腺組織中IL-6、TNF-α、NF-κBp65蛋白水平、NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率，升高胰腺組織中IκB-α蛋白水平。分析重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活、炎癥細(xì)胞因子水平升高，胰腺組織受損；紫草素可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路、降低其胰腺組織中炎性細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織的保護(hù)作用，且高劑量紫草素對(duì)重癥急性胰腺炎的保護(hù)作用較低劑量組顯著(對(duì)于紫草素對(duì)重癥急性胰腺炎的保護(hù)作用是否呈劑量依賴(lài)性及何種劑量為最佳劑量？本文由于篇幅有限未對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)研究和探討，我們將在接下來(lái)的研究中對(duì)其進(jìn)行專(zhuān)項(xiàng)研究和探討)。

綜上所述，在重癥急性胰腺炎中，紫草素可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)重癥急性胰腺炎的保護(hù)作用。