Cullin7表達(dá)下調(diào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

介衛(wèi)華 趙 彬 李愛紅

河南省漯河市中醫(yī)院內(nèi)三科(462000)

背景：結(jié)腸癌為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高。Cullin7定位于染色體6p21.1，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目的：探討Cullin7表達(dá)下調(diào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法：采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測結(jié)腸癌組織、癌旁組織中Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)。以siRNA沉默Cullin7基因，并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測沉默效果。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法檢測cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)。以siRNA Cullin7聯(lián)合Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535處理結(jié)腸癌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法檢測cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)。結(jié)果：結(jié)腸癌組織中Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。與對(duì)照組相比，siRNA Cullin7 1組、siRNA Cullin7 2組、siRNA Cullin7 3組Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，尤其是siRNA Cullin7 2組。與對(duì)照組相比，沉默Cullin7表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。與siRNA Cullin7 2組相比，聯(lián)合Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535后，結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率明顯增加，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：Cullin7基因參與了結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和凋亡，沉默Cullin7可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

結(jié)腸癌為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致臨床治療失敗的重要原因[1-2]。因此，尋求早期能夠阻斷癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的靶向分子，對(duì)于結(jié)腸癌的臨床治療具有一定意義。Cullin7定位于染色體6p21.1，具有高度保守的Cullin結(jié)構(gòu)域，為泛素連接酶亞基，在多種惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、卵巢癌等)中高表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。已有研究[4]結(jié)果表明，與Cullin7低表達(dá)的肝癌患者相比，高表達(dá)的肝癌患者的預(yù)后不良。目前對(duì)于Cullin7在結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確。本研究采用siRNA沉默結(jié)腸癌細(xì)胞株中Cullin7表達(dá)，并觀察Cullin7在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡中的作用，旨在分析其機(jī)制，從而為臨床結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116(購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，編號(hào)TCHu99)。Cullin7 Human siRNA(OriGene Technologies)，其中Cullin7 1-siRNA正義鏈序列：5’-CAA GCA GCA UCA UGA GAA ACC-3’，反義鏈序列：5’-UUU CUC AUG AUG CUG CUU GGA-3’；Cullin7 2-siRNA正義鏈序列：5’-GAG CGA GAA GGA AGA GGA AGC-3’，反義鏈序列：5’-UUC CUC UUC CUU CUC GCU CUU-3’；Cullin7 3-siRNA正義鏈序列：5’-GAU CGA AGA CCA CAG ACG AAC-3’，反義鏈序列：5’-UCG UCU GUG GUC UUC GAU CUG-3’；Cullin7陰性對(duì)照正義鏈序列：5’-AGU GAG AAC CGC ACA GAC CAA-3’，反義鏈序列：5’-UCU CUU GGU AUG CGG UCU GUC-3’；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人Cullin7、cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白抗體、羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535(美國Abcam公司)。

二、方法

1. 組織標(biāo)本：標(biāo)本源自2015年1月—2018年1月于河南省漯河市中醫(yī)院接受手術(shù)治療的15例結(jié)腸癌患者，診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)，且術(shù)前患者均未接受過化療等相關(guān)腫瘤治療。15例結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織(取自距腫瘤邊緣>5 cm處)均于術(shù)后30 min內(nèi)置于液氮罐中凍存。標(biāo)本使用前均取得患者的知情同意，研究方案通過漯河市中醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組：轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于6孔板。將細(xì)胞隨機(jī)分為siRNA Cullin7 1組、siRNA Cullin7 2組、siRNA Cullin7 3組、陰性對(duì)照組、對(duì)照組。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔2 mL，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%以上融合度時(shí)，更換為無血清無雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)。依據(jù)LipofectamineTM2000說明書，采用無血清無雙抗培養(yǎng)基分別稀釋LipofectamineTM2000和siRNA(Cullin7 1-siRNA序列、Cullin7 2-siRNA序列、Cullin7 3-siRNA序列、Cullin7陰性對(duì)照序列、空載體)至所需濃度，混勻，靜置20 min，加入預(yù)先采用無血清無雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h的細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3. qRT-PCR法檢測Cullin7 mRNA表達(dá)：收集結(jié)腸癌及其相應(yīng)癌旁正常組織以及各組結(jié)腸癌細(xì)胞，以Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。采用BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)試劑盒，選取2 μL cDNA于20 μL反應(yīng)體系行qRT-PCR。循環(huán)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)引物序列。Cullin7(NM_001168370.1)上游序列：5’-CCT ACC TGA GGG GCA CTT TG-3’，下游：5’-ATC TTG AGG ACC CCT CCT GG -3’，產(chǎn)物大小為187 bp；GAPDH(M17851.1)上游引物：5’-GAG CCA CAT CGC TCA GAA CAC-3’，下游：5’-TCA CAA GCT TCC CGT TCT CA -3’，產(chǎn)物大小為228 bp。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

4. 蛋白質(zhì)印跡法檢測Cullin7蛋白表達(dá)：收集結(jié)腸癌及其相應(yīng)癌旁正常組織以及各組結(jié)腸癌細(xì)胞，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，調(diào)整各樣本蛋白總量，行10% SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，3% BSA阻斷1 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，洗膜后添加二抗(1∶3 000)，搖床上搖動(dòng)1 h，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，以β-actin蛋白條帶灰度值為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

5. CCK-8法測定細(xì)胞活力：取對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA Cullin7 2組細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于96孔板，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h、72 h，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后上酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的每孔吸光度(A)值，以空白對(duì)照組調(diào)零，計(jì)算抑制率。

6. 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況：收集轉(zhuǎn)染48 h的對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA Cullin7 2組細(xì)胞，以胰酶消化，1 000×g離心5 min，收集并重懸細(xì)胞，1 000×g離心5 min，加入500 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，然后加入5 μL PI，混勻，室溫孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

7. 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)：取對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA Cullin7 2組細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測cleaved caspase-3(工作濃度為1∶2 000)、β-catenin(工作濃度為1∶2 000)、C-myc(工作濃度為1∶3 000)蛋白表達(dá)，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

8. Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)沉默Cullin7結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響：取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA Cullin7 2組的結(jié)腸癌細(xì)胞，并分為兩組，其中一組給予正常培養(yǎng)，另一組在培養(yǎng)液中加入終濃度為20 μmol/L的Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535。培養(yǎng)24 h后，以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法檢測cleaved caspase-3(工作濃度為1∶2 000)、β-catenin(工作濃度為1∶2 000)、C-myc(工作濃度為1∶3 000)蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Cullin7在癌旁正常組織和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

與癌旁正常組織相比，結(jié)腸癌組織中Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1、表1)。

二、siRNA Cullin7下調(diào)HCT116細(xì)胞中Cullin7的表達(dá)

與對(duì)照組相比，siRNA Cullin7 1組、siRNA Cullin7 2組、siRNA Cullin7 3組Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)(圖2、表2)，其中siRNA Cullin7 2組下降幅度最大，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇siRNA Cullin7 2組進(jìn)行研究。

1：癌旁正常組織；2：結(jié)腸癌組織

組 別例數(shù)mRNA表達(dá)蛋白表達(dá)癌旁正常組織150.24±0.020.16±0.04結(jié)腸癌組織150.84±0.060.43±0.04t值16.4328.267P值0.0000.001

1：對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：siRNA Cullin7 1組；4：siRNA Cullin7 2組；5：siRNA Cullin7 3組

圖2siRNA Cullin7下調(diào)HCT116細(xì)胞中Cullin7蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

表2siRNA Cullin7下調(diào)HCT116細(xì)胞中Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)

三、siRNA Cullin7抑制HCT116細(xì)胞增殖

對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA Cullin7 2組之間HCT116細(xì)胞A值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.029，P<0.05)；隨著時(shí)間延長，三組A值呈增長趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.648，P<0.05)；且處理因素與時(shí)間之間存在交互作用(F=2.579，P<0.05)(圖3)。

四、siRNA Cullin7誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA Cullin7 2組的細(xì)胞凋亡率分別為4.49%±0.03%、5.48%±0.05%、21.38%±0.74%，其中siRNA Cullin7 2組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。

培養(yǎng)時(shí)間

五、siRNA Cullin7對(duì)HCT116細(xì)胞中cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，siRNA Cullin7 2組HCT116細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，而β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5、表3)。

六、抑制Wnt信號(hào)通路協(xié)同沉默Cullin7對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

與siRNA Cullin7 2組相比，聯(lián)合Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535處理后，結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率明顯增加(36.14%±1.02%對(duì)23.92%±0.82%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。

七、抑制Wnt信號(hào)通路協(xié)同沉默Cullin7對(duì)cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc表達(dá)的影響

與siRNA Cullin7 2組相比，聯(lián)合Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535處理后，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖7、表4)。

討 論

Cullin7為Cullin蛋白家族中較晚開始研究的成員，基因高度保守，其本身并不是促癌基因或抑癌基因，主要通過底物蛋白影響細(xì)胞信號(hào)通路，并進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤的形成[5-6]。有研究顯示，Cullin7在絨毛膜癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，為一種致癌基因，與腫瘤的增殖、凋亡、惡性進(jìn)展等存在一定的聯(lián)系，以Cullin7為靶點(diǎn)的藥物和基因治療也引起越來越多的重視[7]。Cullin7過表達(dá)在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中起有重要作用，可能是肝細(xì)胞癌管理的重要標(biāo)志物，沉默Cullin7可顯著降低肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[8]。此外，有研究[9]發(fā)現(xiàn)Cullin7高表達(dá)與上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，并可下調(diào)p53表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲。Men等[10]發(fā)現(xiàn)，Cullin7在肺癌中過表達(dá)是肺癌細(xì)胞增殖所必需的條件。本研究結(jié)果顯示，Cullin7 mRNA和蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織，提示Cullin7表達(dá)增高在結(jié)腸癌的發(fā)生中可能起一定的促進(jìn)作用。

A：對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siRNA Cullin7 2組

1：對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：siRNA Cullin7 2組

組 別cleaved caspase-3β-cateninC-myc對(duì)照組0.27±0.050.67±0.060.52±0.06陰性對(duì)照組0.26±0.070.69±0.050.54±0.05siRNA Cullin7 2組0.43±0.070.31±0.050.37±0.04F值6.65947.86010.090P值0.0300.0000.012

A：siRNA Cullin7 2組；B：siRNA Cullin7 2+FH-535組

1：siRNA Cullin7 2組；2：siRNA Cullin7 2+FH-535組

組 別cleaved caspase-3β-cateninC-mycsiRNA Cullin7 2組0.39±0.050.38±0.050.41±0.06siRNA Cullin7 2+FH-535組0.63±0.060.15±0.030.17±0.04t值5.3226.8325.765P值0.0030.0010.002

RNA干擾主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，廣泛用于目前的科學(xué)研究。結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病原因比較復(fù)雜，機(jī)制目前尚不明確。因此，尋求一種新的治療靶點(diǎn)對(duì)結(jié)腸癌的治療、預(yù)后具有一定的臨床價(jià)值[11]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Cullin7 siRNA 48 h后，結(jié)腸癌細(xì)胞中Cullin7 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，提示siRNA可特異性下調(diào)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中Cullin7表達(dá)。已有研究顯示，Cullin7結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素水平失衡，引起細(xì)胞凋亡紊亂，造成惡性增殖[12]。本研究進(jìn)一步采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染Cullin7 2-siRNA后的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示siRNA Cullin7 2組在轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h的A值均明顯低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組；流式細(xì)胞術(shù)示siRNA Cullin7 2組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。提示阻斷Cullin7表達(dá)可有效抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，轉(zhuǎn)染Cullin7 siRNA后，凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加，表明下調(diào)Cullin7表達(dá)可通過caspase信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin為一種比較保守的信號(hào)通路，從低等的果蠅到高等的哺乳動(dòng)物中均具有高度保守的同源性，與細(xì)胞生長、凋亡、黏附存在一定的聯(lián)系[13-14]。β-catenin是該經(jīng)典通路的關(guān)鍵蛋白，通過調(diào)控包括C-myc等在內(nèi)的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)影響癌細(xì)胞的生長過程[15]。β-catenin在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，抑制其表達(dá)可逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的表型。潘安萍等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，沉默β-catenin表達(dá)可促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，降低細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，其作用機(jī)制可能與影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，沉默Cullin7表達(dá)后，β-catenin、C-myc表達(dá)明顯降低，cleaved caspase-3表達(dá)明顯增加；聯(lián)合Wnt信號(hào)通路抑制劑FH-535后，β-catenin、C-myc表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，cleaved caspase-3表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。提示下調(diào)Cullin7表達(dá)可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，Cullin7基因參與了結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和凋亡，沉默Cullin7表達(dá)可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明Cullin7有望成為結(jié)腸癌基因治療的新靶點(diǎn)。然而，腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程，涉及多種基因和多種信號(hào)傳遞的過程，尚存在許多未知的機(jī)制需行進(jìn)一步研究。

致謝本實(shí)驗(yàn)均在漯河市醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此表示感謝！