趙秋艷 余蘭婷 謝浩然 任迎春 陳素敏 李百文
上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院(201620)
背景:大量研究表明microRNAs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MiR-21為最為常見的致癌性microRNAs分子之一,其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移的具體作用及其機(jī)制尚未完全闡明。目的:探討miR-21對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及其具體分子機(jī)制。方法:以PANC-1和MIA PaCa-2細(xì)胞為研究對(duì)象,通過轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體分別構(gòu)建miR-21過表達(dá)和敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,以qRT-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)Spry2 mRNA和蛋白表達(dá),螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-21對(duì)Spry2的調(diào)控作用。結(jié)果:MiR-21過表達(dá)可明顯促進(jìn)PANC-1細(xì)胞增殖和遷移(P<0.05),miR-21表達(dá)下調(diào)可明顯降低MIA PaCa-2細(xì)胞增殖和遷移(P<0.05)。與對(duì)照組相比,miR-21表達(dá)上調(diào)可明顯降低Spry2 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05),而敲低miR-21表達(dá)可明顯升高Spry2 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)。上調(diào)miR-21表達(dá)可抑制含野生型Spry2 3’-UTR序列質(zhì)粒的螢光素酶活性(P<0.05),下調(diào)miR-21表達(dá)則增強(qiáng)螢光素酶活性(P<0.05)。Spry2可逆轉(zhuǎn)miR-21介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移(P<0.05)。結(jié)論:MiR-21能通過靶向調(diào)節(jié)Spry2的表達(dá)而影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。
胰腺癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見消化系統(tǒng)腫瘤,亦是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法,大多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)即處于疾病晚期,失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此探討胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,并尋找早期診斷和預(yù)后判斷指標(biāo)是胰腺癌研究中亟待解決的重大問題。微RNAs(microRNAs, miRNAs)是一類小分子非編碼RNA,通過與靶基因mRNA 3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)的堿基互補(bǔ)配對(duì),促進(jìn)mRNA降解或抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[2-4]。大量研究表明,miRNAs失調(diào)與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5-6]。MiR-21作為最為常見的致癌性miRNAs分子之一,在胰腺癌中高表達(dá),然而其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移的具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建miR-21過表達(dá)和敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,旨在探討miR-21對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其可能的分子機(jī)制。
一、細(xì)胞株和主要試劑
人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1、MIA PaCa-2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);慢病毒的構(gòu)建由漢恒生物技術(shù)(上海)有限公司完成;miR-21 mimics、陰性對(duì)照mimics NC、miR-21 inhibitor、陰性對(duì)照inhibitor NC、Spry2過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;Spry2敲低寡核苷酸(Si-Spry2)、陰性對(duì)照(Si-NC)和EdU試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司;兔抗人Spry2、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒由和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司構(gòu)建。
二、方法
1. 細(xì)胞培養(yǎng):PANC-1、MIA PaCa-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),每2 d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為80%~90%時(shí)常規(guī)傳代培養(yǎng)。
2. 慢病毒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞匯合率為50%~70%時(shí),加入適量病毒,感染48 h后更換含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)基,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。每2~3 d更換一次含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基,直至不感染病毒的篩選對(duì)照組細(xì)胞被嘌羅霉素殺光,以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。
3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將穩(wěn)轉(zhuǎn)株分別接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)70%時(shí),應(yīng)用LipofectamineTM2000對(duì)miR-21過表達(dá)的PANC-1穩(wěn)轉(zhuǎn)株(LV-miR-21)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Spry2過表達(dá)質(zhì)粒(Spry2)和空載質(zhì)粒(EV),對(duì)miR-21敲低的MIA PaCa-2穩(wěn)轉(zhuǎn)株(SP-miR-21)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Si-RNA和Si-NC,6 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,以qRT-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。
4. qRT-PCR法:收集各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS清洗后加入Trizol試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。miR-21上游引物:5’-CGC GCG TAG CTT ATC AGA CTG A-3’,下游:5’-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3’;內(nèi)參U6上游引物:5’-CAA GGA TGA CAC GCA AA-3’,下游:5’-TCA ACT GGT GTC GTG G-3’;Spry2上游引物:5’-AAG CCA CTG AGC AAG GAA GA-3’,下游:5’-TTG TCG CAG ATC CAG TCT GA-3’;內(nèi)參GAPDH上游引物:5’-GGG AAG GTG AAG GTC GGA GT-3’,下游:5’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC A-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
5. 蛋白質(zhì)印跡法:收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,提取各組細(xì)胞的總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,各組蛋白調(diào)整同一濃度,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Spry2蛋白表達(dá)。兔抗人Spry2、GAPDH一抗稀釋濃度為1∶1 000,羊抗兔二抗稀釋濃度為1∶2 000。ECL法顯影并保存圖像。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示目的蛋白表達(dá)量。
6. CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并接種于96孔板,培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后,每孔分別加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,上酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的各孔吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線圖。
7. 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后,使用200 μL移液器吸頭在細(xì)胞層進(jìn)行劃痕,PBS洗去細(xì)胞碎片,倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照(0 h)并記錄拍攝位置。加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h,倒置顯微鏡下拍照。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件測(cè)量長(zhǎng)度。
8. 螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):將狀態(tài)良好的PANC-1、MIA PaCa-2細(xì)胞接種于24孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%~70%時(shí),用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別將miR-21 mimics或mimics NC與野生型Spry2 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒(Wt-Spry2)或突變型Spry2 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒(Mut-Spry2)共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞,將miR-21 inhibitor或inhibitor NC與Wt-Spry2或Mut-Spry2共轉(zhuǎn)染MIA PaCa-2細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)36 h后檢測(cè)螢光素酶活性。
三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
一、慢病毒轉(zhuǎn)染后miR-21在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)
qRT-PCR法結(jié)果顯示,PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21過表達(dá)的慢病毒載體(LV-miR-21)后,miR-21表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)(P<0.05)(圖1A);而MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21敲低的慢病毒載體(SP-miR-21)后,miR-21表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)(P<0.01)(圖1B)。
二、MiR-21表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響
CCK-8法結(jié)果顯示,miR-21表達(dá)上調(diào)后PANC-1細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖2A),而miR-21表達(dá)下調(diào)后MIA PaCa-2細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)(圖2B)。表明miR-21表達(dá)能增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。
三、MiR-21表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,miR-21過表達(dá)可明顯促進(jìn)PANC-1細(xì)胞遷移(P<0.05)(圖2C);與對(duì)照組相比,miR-21敲低能明顯抑制MIA PaCa-2細(xì)胞遷移(P<0.05)(圖2D)。提示miR-21表達(dá)能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移。
四、Spry2是miR-21的靶基因
采用預(yù)測(cè)軟件TargetScan、miRBase、PicTa等進(jìn)行生物學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)在Spry2 mRNA的3’-UTR含有miR-21結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,miR-21 mimics組Spry2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05),而miR-21 inhibitor組Spry2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上升(P<0.05)(圖3B)。螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21 mimics和Spry2野生型質(zhì)粒后,螢光素酶活性較對(duì)照組明顯降低(P<0.05),同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor和Spry2野生型質(zhì)粒后,螢光素酶活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.01),而突變組中螢光素酶活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3C)。說明miR-21可直接靶向調(diào)控Spry2表達(dá)。
A:PANC-1細(xì)胞中miR-21表達(dá);B:MIA PaCa-2細(xì)胞中miR-21表達(dá)
圖1慢病毒轉(zhuǎn)染后miR-21在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)(qRT-PCR法)
A:miR-21過表達(dá)促進(jìn)PANC-1細(xì)胞增殖;B:miR-21敲低抑制MIA PaCa-2細(xì)胞增殖;C:miR-21過表達(dá)促進(jìn)PANC-1細(xì)胞遷移;D:miR-21敲低抑制MIA PaCa-2細(xì)胞遷移
圖2 miR-21表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響
A:生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-21與Spry2的結(jié)合位點(diǎn);B:miR-21上下調(diào)后對(duì)Spry2 mRNA和蛋白水平的影響;C:螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖3 Spry2是miR-21的靶基因
五、Spry2對(duì)miR-21介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移能力的影響
在PANC-1細(xì)胞中,與LV-miR-21+EV組相比,LV-miR-21+Spry2組細(xì)胞增殖、遷移能力明顯降低(P<0.05)(圖4A);在MIA PaCa-2細(xì)胞中,與SP-miR-21+Si-NC組相比,SP-miR-21+Si-Spry2組細(xì)胞增殖、遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖4B)。
胰腺癌具有高度侵襲性,預(yù)后極差,發(fā)病率接近于死亡率[7]。近年來,胰腺癌發(fā)生率和死亡率逐年上升,預(yù)計(jì)在2030年將成為癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因[8]。目前已發(fā)現(xiàn)大量信號(hào)通路、生長(zhǎng)因子、原癌基因、抑癌基因等參與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展[9],但仍未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。有研究表明,miRNAs參與腫瘤細(xì)胞的增殖和分化,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11],有望成為腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。
A:Spry2逆轉(zhuǎn)miR-21誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移;B:Si-Spry2促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移
圖4 Spry2對(duì)miR-21介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移能力的影響
MiR-21在幾乎所有惡性腫瘤中異常表達(dá),并參與腫瘤的形成和進(jìn)展。在結(jié)直腸癌中,miR-21通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制抑癌基因Pdcd4表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。在乳腺癌細(xì)胞中,miR-21通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)而抑制癌細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)腫瘤形成[13]。大量研究顯示,miR-21在胰腺癌中的表達(dá)升高[14-15],且與胰腺癌的化療抵抗密切相關(guān),下調(diào)miR-21表達(dá)可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性[16-17]。本研究成功構(gòu)建了以慢病毒介導(dǎo)的miR-21過表達(dá)和敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。CCK-8和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-21過表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和遷移,而miR-21表達(dá)下調(diào)能抑制MIA PaCa-2細(xì)胞增殖和遷移。
MiRNAs通過調(diào)節(jié)下游靶基因而發(fā)揮生物學(xué)作用,一種miRNAs能調(diào)控多種靶基因的表達(dá)[18]。本研究中,通過生物學(xué)信息預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-21的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),篩選出Spry2作為潛在的目的基因。Spry2是受體酪氨酸激酶信號(hào)通路的抑制物[19-20],能抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[21],并作為抑癌基因在多種腫瘤中發(fā)揮作用[22]。近期一項(xiàng)研究[23]表明,Spry2在胃癌組織中的表達(dá)降低,且與患者的5年生存率呈正相關(guān)。Shukla等[24]的研究發(fā)現(xiàn)Spry2在慢性淋巴性白血病(CLL)中的表達(dá)下調(diào),并通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)B細(xì)胞受體和MAPK信號(hào)通路而促進(jìn)CLL的發(fā)生、發(fā)展。本研究中,首先利用TargetScan、miRBase、PicTa等預(yù)測(cè)軟件篩選出miR-21的靶基因Spry2。隨后qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法表明Spry2可能是miR-21的靶基因。螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21可與Spry2的3’-UTR結(jié)合,并調(diào)控Spry2的表達(dá)。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Spry2能逆轉(zhuǎn)miR-21誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移。由此可見,miR-21可通過下調(diào)Spry2表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。
綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí)了miR-21能通過靶向調(diào)節(jié)Spry2表達(dá)而影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能,有望為胰腺癌的診斷和治療提供更廣闊的前景。