丹參酮IIA抑制胃癌細(xì)胞的阿霉素耐藥*

劉 源， 倪漸鳳， 劉麗娜， 李芳芳， 尹先哲

(南陽市第二人民醫(yī)院 1腫瘤科， 2血液科， 河南 南陽 473012； 3南陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科, 河南 南陽 473000)

胃癌是常見的惡性腫瘤，在我國，胃癌發(fā)病率和死亡率分別占據(jù)所有腫瘤的第3位和第5位[1]?；熓俏赴┑闹饕委熗緩街?，但胃癌患者獲得性耐藥一直制約著化療效果。阿霉素(又稱多柔比星，doxorubicin，DOX)是常見的胃癌化療藥物，而當(dāng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性時(shí)，化療效果則會(huì)降低[2]。DOX是滲透性糖蛋白(permeability glyprotein，P-gp)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)及多重耐藥相關(guān)蛋白1(muti-drug resistance-associated protein-1，MRP-1)的反應(yīng)底物[3]。在腫瘤細(xì)胞中，過表達(dá)P-gp、BCRP及MRP-1這些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體可使DOX外排，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DOX濃度，從而降低化療效果[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)丹參可以抑制DOX等化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的表達(dá)，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌的細(xì)胞凋亡[5]。丹參的主要有效化合物為丹參酮IIA(tanshinone IIA，TAN IIa)，也是丹參中含量最多的成分。本研究主要關(guān)注于Tan IIA對(duì)耐DOX胃癌細(xì)胞的DOX化療敏感性的改變和機(jī)制，為治療耐DOX胃癌的化療提供新的方法。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌細(xì)胞系SNU-216、SNU-601、SNU-620、SNU-638、SNU-668和SNU-719購自于中國細(xì)胞資源庫保藏中心。丹參酮IIA及阿霉素(Sigma-Aldrich)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen)；胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)；CCK-8染色液和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體(上海生工)；Annexin V/PI染色試劑盒(Biotool)；周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)抗體(Santa Cruz)；抗MRP-1抗體(Abcam)；抗p21和p53抗體(Cell Signaling Technology)；抗cyclin B1及LC3-II抗體(Biosis)；抗Bax及Bcl-2抗體(Thermo Fisher)；PVDF膜(Bio-Rad)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) SNU-216、SNU-601、SNU-620、SNU-638、SNU-668和SNU-719細(xì)胞生長于含有10% FBS的高糖RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入100 mg/L鏈霉素及1×105U/L青霉素。逐級(jí)加大DOX濃度(1 μg/L直至1 mg/L)從親本細(xì)胞系中多次篩選獲得耐DOX細(xì)胞系SNU-719R及SNU-601R。通過DOX逐級(jí)篩選，最終獲得的耐DOX細(xì)胞系SNU-601R及SNU-719R的IC50分別為0.271 mg/L和0.286 mg/L，較其親本細(xì)胞系SNU-601及SNU-719分別提高了6.2倍和7.9倍，進(jìn)一步證明了其耐DOX性。

2.2MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入200 μL密度為2.5×107/L的細(xì)胞。DOX處理24 h、48 h及72 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃、4 h。加入150 μL DMSO，振蕩10 min，利用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Bio-Rad，Hercules)在490 nm處測(cè)量各孔吸光度(A)值。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 加入1 mL濃度為1.0×108/L的胃癌細(xì)胞至24孔板中，在檢測(cè)細(xì)胞周期前用DOX或(和)Tan IIA處理24 h，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入70%乙醇-20 ℃固定過夜，1 600×g離心5 min，用含碘化丙啶和核酸酶的染色液重懸15 min后，BDLSR Fortesse細(xì)胞分析儀(BD Biosciences)于488 nm激光發(fā)射器處激發(fā)，同時(shí)檢測(cè)575 nm處的熒光強(qiáng)度。

2.4RT-qPCR測(cè)定藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在胃癌細(xì)胞中的表達(dá) 首先，按照指定方案實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞，然后收集已處理的細(xì)胞于EP管中，按照 RNAisoPLus說明書步驟，依次采用RNAisoPLus變性緩沖液、20%體積氯仿、異丙醇、75%乙醇萃取細(xì)胞總RNA。其次，取1 μg總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再次取cDNA模板和目的基因引物，按照按照SuperReal PreMix試劑盒說明書利用ABI 7500熒光定量 PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 2 s、60 ℃ 30 s、66 ℃ 1 min，共40循環(huán)。選用GAPDH作為目的基因的內(nèi)參照，目的基因的相對(duì)表達(dá)結(jié)果以2-ΔΔCt表示。P-gp的正向引物序列為5’-TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3’，反向引物序列為5’-CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG-3’；BCRP的正向引物序列為5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’，反向引物序列為5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’；MRP1的正向引物序列為5’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3’，反向引物序列為5’-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-TGCCGCCTGGAGAAACC-3’，反向引物序列為5’-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3’。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康模肦IPA裂解液萃取細(xì)胞全蛋白。利用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V，時(shí)間為2 h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以1 ∶1 000的稀釋比例孵育Ⅰ抗(抗MRP-1、CDK1、p21、p53、cyclin B1、LC3-II、Bax及Bcl-2抗體)， 4 °C過夜。次日，以TBST洗滌后于室溫下孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的 II 抗1 h，最終以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，對(duì)于多組定量資料的兩兩比較，數(shù)據(jù)在方差齊的條件下，采用單因素方差分析及Bonferroni法進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 6種人胃癌細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性

首先，本研究檢測(cè)了6種人胃癌細(xì)胞在DOX中暴露24 h、48 h及72 h時(shí)細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示經(jīng)過24 h的處理，IC50值最高的為SNU-620細(xì)胞(0.537 mg/L)，其次分別為SNU-216細(xì)胞(0.289 mg/L)、SNU-668細(xì)胞(0.225 mg/L)、SNU-638細(xì)胞(0.143 mg/L)、SNU-601細(xì)胞(0.044 mg/L) 和SNU-719細(xì)胞(0.036 mg/L)。SNU-620細(xì)胞表現(xiàn)出最大的耐藥性而SNU-719細(xì)胞最敏感，見圖1。由于SNU-620與SNU-719在24 h時(shí)的IC50差異大于2者在48 h及72 h時(shí)的差異，因此，本研究選取24 h時(shí)點(diǎn)作為后續(xù)細(xì)胞處理時(shí)間。另外，由于SNU-601 細(xì)胞與SNU-719細(xì)胞對(duì)DOX最為敏感，因此，本研究通過逐步加大DOX濃度(1 μg/L～1 mg/L)篩選獲得了2種耐DOX細(xì)胞系SNU-601R 及SNU-719R。每種細(xì)胞分為3組，對(duì)照組用PBS處理；DOX組給予DOX 0.5 mg/L處理；DOX+ Tan IIA 組用0.5 mg/L DOX+5 μmol/L Tan IIA處理。

Figure 1. The cytotoxicity of doxorubicin (DOX) on gastric cancer cells. The IC50 values of DOX for a panel of gastric cancer cells were showed. The cells were treated with DOX at a series of concentrations for 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD. n=3.

2 Tan IIA抑制MRP-1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的DOX外排

RT-qPCR結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中P-gp及BCRP的mRNA表達(dá)并無明顯差異，但SNU-638、SNU-216及SNU-620細(xì)胞的MRP-1 mRNA明顯升高(P<0.05)。DOX是MRP-1的底物之一，過表達(dá)MRP-1可減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DOX積聚，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥。經(jīng)過藥物篩選得到的耐DOX細(xì)胞株SNU-601R與SNU-719R的MRP-1 mRNA表達(dá)水平也均較相應(yīng)的正常細(xì)胞株升高(P<0.01)，見圖2B、C。因此，DOX可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的MRP-1表達(dá)上調(diào)。

經(jīng)過Tan IIA (5 μmol/L)處理后，SNU-719R細(xì)胞及SNU-620細(xì)胞的MRP-1在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均較control組降低(P<0.01)，見圖2D、E。

Figure 2. Inhibition of MRP-1-mediated efflux of doxorubicin (DOX) by tanshinone IIA. A: the relative mRNA expression of drug efflux transporters P-gp, BCRP and MRP-1 in a panel of gastric cancer cells; B: the relative mRNA expressions of drug efflux transporters P-gp, BCRP and MRP-1 in DOX-selected gastric cancer cells SNU-601R; C: the relative mRNA expressions of drug efflux transporters P-gp, BCRP and MRP-1 in DOX-selected gastric cancer cells SNU-719R; D: the relative protein expression of MRP-1 in gastric cancer cells after treatment with tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h; E: the mRNA expression of MRP-1 in gastric cancer cells after treatment with tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs SNU-719 group; ##P<0.01 vs SNU-601 group;**P<0.01 vs control group.

3 Tan IIA誘導(dǎo)耐DOX胃癌細(xì)胞周期停滯

DOX可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，因此，本研究檢測(cè)了胃癌細(xì)胞系SNU-719，SNU-719R及SNU-620的細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，單用DOX處理能降低SNU-719細(xì)胞在G2/M期細(xì)胞的數(shù)量，而SNU-719R及SNU-620細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞分布無差異；與單用DOX處理組相比，5 μmol/L Tan IIA與DOX聯(lián)用能減少SNU-719R及SNU-620細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)，而SNU-719細(xì)胞中兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖3A。同時(shí)，本研究也檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、cyclin B1及CDK1的表達(dá)。經(jīng)DOX處理后，SNU-719R細(xì)胞的p21、cyclin B1及CDK1表達(dá)水平與control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而經(jīng)5 μmol/L Tan IIA與DOX聯(lián)用處理后，p21的表達(dá)水平升高，而cyclin B1及CDK1的表達(dá)水平較DOX組均降低(P<0.05),見圖3B。同樣的，SNU-620細(xì)胞DOX組的p21、cyclin B1及CDK1較control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而經(jīng)5 μmol/L Tan IIA處理后，p21的表達(dá)水平升高，而cyclin B1及CDK1較DOX組均降低(P<0.05),見圖3C。

Figure 3.Tanshinone IIA enhanced doxorubicin-induced cell cycle arrest in drug-resistant gastric cancer cells. A: the cell cycle distribution in the gastric cancer cells after treated with DOX at 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA (5 μmol/L) for 24 h; B: the protein expression of p21, cyclin B1 and CDK1 in the gastric cancer SNU-719 cells and DOX resistant SNU-719R cells after treated with DOX at 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h; C: the protein expression of p21, cyclin B1 and CDK1 in the gastric cancer SNU-719 cells and DOX resistant SNU-620 cells after treated with DOX at 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs DOX group.

4 Tan IIA誘導(dǎo)耐DOX胃癌細(xì)胞凋亡與自噬

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DOX對(duì)SNU-719R及SNU-620細(xì)胞的p53、Bax及Bcl-2表達(dá)均無影響，但DOX與Tan IIA合用卻可升高這兩種細(xì)胞的p53及Bax，降低Bcl-2，與DOX組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4A、B。DOX處理后，SNU-719R細(xì)胞及SNU-620細(xì)胞的LC3B-II及p62與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但DOX與Tan IIA合用時(shí)，LC3B-II較DOX組升高，而p62較DOX組下降。提示DOX與Tan IIA合用時(shí)可誘導(dǎo)耐DOX細(xì)胞自噬增強(qiáng)(P<0.05)，見圖4C、D。

Figure 4.Tanshinone IIA increased DOX-induced apoptosis and autophagy in drug-resistant gastric cancer cells. A: the protein expression of p53, Bax and Bcl-2 in the gastric cancer SNU-719 cells and DOX resistant SNU-719R cells after treatment with DOX at 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h; B: the protein expression of p53, Bax and Bcl-2 in the gastric cancer SNU-719 cells and DOX resistant SNU-620 cells after treated with DOX 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h; C: the protein expression of LC3B-II and p62 in the gastric cancer SNU-719 cells and DOX resistant SNU-719R cells after treated with DOX at 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h; D: the protein expression of LC3B-II and p62 in the gastric cancer SNU-719 cells and DOX resistant SNU-620 cells after treated with DOX at 0.5 mg/L with or without tanshinone IIA at 5 μmol/L for 24 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DOX group.

討 論

胃癌耐藥性的產(chǎn)生與許多因素相關(guān)，包括藥物排出、藥物失活、前藥活性降低、藥物靶點(diǎn)改變、細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)失調(diào)、缺氧、細(xì)胞外基質(zhì)改變、細(xì)胞因子、以及微小RNA的參與[6]。丹參酮是從丹參中分離的親脂性成分，丹參是一種在亞洲國家廣泛用于治療心血管和肝病的傳統(tǒng)中藥[7]，且丹參滴丸目前正對(duì)于評(píng)估其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者療效和安全性的III期臨床試驗(yàn)中[8]。丹參酮IIA是丹參中含量最豐富的丹參酮，為了評(píng)價(jià)丹參的抗腫瘤活性，研究丹參酮IIA的抗腫瘤活性尤為重要[9]。有研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長并逆轉(zhuǎn)其惡性表型，然而，關(guān)于丹參酮IIA抑制胃癌耐藥性的研究很少[10]。盡管丹參酮IIA對(duì)本研究中使用的胃癌細(xì)胞幾乎無細(xì)胞毒性，但我們的發(fā)現(xiàn)表明它具有增強(qiáng)阿霉素對(duì)耐藥胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力。在耐阿霉素的胃癌細(xì)胞SNU-216、SNU-620、SNU-719R和SNU-610R中，P-gp和MRP-1在介導(dǎo)一些胃癌細(xì)胞系的耐藥性方面都起著重要作用，本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP-1過表達(dá)。P-gp、BCRP和MRP-1是3種常見的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，它們被發(fā)現(xiàn)在耐藥性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并通過減少其底物抗腫瘤藥物的細(xì)胞內(nèi)積累而賦予腫瘤細(xì)胞的耐藥性[11-12]。我們的研究結(jié)果顯示MRP-1過表達(dá)在胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的內(nèi)源性和獲得性耐藥性發(fā)展中均起到關(guān)鍵作用。

在本研究中，我們報(bào)道了丹參酮IIA對(duì)胃癌細(xì)胞MRP-1排出功能的抑制作用。丹參酮IIA與阿霉素聯(lián)用可抑制DOX的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP-1將DOX泵出細(xì)胞外，提高細(xì)胞內(nèi)DOX濃度，且可降低cyclin B1水平，通過Bax-caspase-3通路促進(jìn)凋亡。丹參酮IIA對(duì)胃癌細(xì)胞的MRP-1的抑制作用與另一研究中丹參酮IIA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MRP-1表達(dá)的下調(diào)機(jī)制是一致的[13]。除了MRP-1的過度表達(dá)外，我們還發(fā)現(xiàn)阿霉素耐藥的胃癌細(xì)胞存在抑制性凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，即促凋亡蛋白p53和Bax的表達(dá)下調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2上調(diào)。抗凋亡有助于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，因許多抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)凋亡破壞腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤生長。凋亡和自噬分別是I型和II型程序性細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)自噬被認(rèn)為是一種潛在的治療抗凋亡腫瘤細(xì)胞的方法[14-15]。在本研究中阿霉素和丹參酮IIA共同作用后，耐DOX胃癌細(xì)胞自噬被激活，其中機(jī)制尚不清楚。另外，cyclin B1具有調(diào)控真核生物有絲分裂的作用，本實(shí)驗(yàn)中給予丹參酮IIA及DOX后，cyclin B1水平較單純DOX組明顯降低，表明丹參酮可明顯抑制由cyclin B1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖與分裂，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期之前，降低G2/M期數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究顯示丹參酮IIA可通過抑制MRP-1功能、增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯、增加細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)自噬來增強(qiáng)耐DOX胃癌細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性。