大黃素對洛哌丁胺致小鼠便秘的治療作用*

計(jì)樹靈， 韓佳瑞， 賀璐璐， 左振魁△

[1河南中醫(yī)藥大學(xué)， 2河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)肛腸科， 河南 鄭州 450000]

便秘是一種常見的胃腸功能紊亂性疾病，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量[1]。并且，長期慢性便秘是結(jié)腸癌、心腦血管病、抑郁和帕金森等疾病的潛在誘因之一[2-3]。目前常用治療便秘的藥物(如莫沙必利、西沙比利和普盧卡必利等)存在心血管不良等副作用[4]。而益生菌制劑對便秘的治療效果并不太理想[5]。Zheng等[6]報道，大黃素(emodin)能通過上調(diào)便秘小鼠腸組織中水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP3)表達(dá)來改善胃腸蠕動而促進(jìn)排便。然而，大黃素對便秘小鼠致瀉的具體機(jī)制并不清楚。因此，本項(xiàng)工作應(yīng)用洛哌丁胺(loperamide，Lop)構(gòu)建小鼠便秘模型，觀察大黃素對便秘小鼠的治療作用及其潛在的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑

一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒購自Promega；RIPA裂解液購自Solarbio；BCA蛋白測定試劑盒購自Thermo；免疫組化檢測試劑盒購于南京建成生物公司；HE染色試劑盒購自廣州賴德生物公司；抗血管活性腸肽受體1(vasoactive intestinal peptide receptor 1，VIPR1)、5-羥色胺4型受體(5-hydroxytryptamine type 4 receptor，5-HT4receptor)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抗體購自Abcam；瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1)抗體購自Abnova；抗c-Kit、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)和β-actin抗體購自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的IgG II抗購自上海碧云天公司；洛哌丁胺試劑購自Sigma-Aldrich。

2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

35只7～8周齡SPF級雄性昆明小鼠[(30±4)g]購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(豫)2017-0001】，小鼠飼養(yǎng)在河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房內(nèi)【SYXK(豫)2015-0005】，室溫(23±1)℃，晝夜循環(huán)12 h，小鼠可自由進(jìn)食進(jìn)水。小鼠飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照(control，Con)組(11只)、Lop組(12只)和Lop+emodin組(12只)組。Lop組小鼠每天早、晚各灌胃1次Lop(9.6 mg/kg)，持續(xù)2周。Lop+emodin組小鼠灌胃Lop時間與頻率同Lop組小鼠，持續(xù)2周，但在灌胃Lop 1周后，每天再灌胃1次大黃素(50 mg/kg)，持續(xù)1周。對照組每天灌胃相同體積生理鹽水。

3 方法

3.1便秘行為觀察以及糞便含水量檢測 給藥結(jié)束后，小鼠在代謝籠中自由活動2 h，記錄小鼠排便次數(shù)并收集糞便。隨后對糞便稱重，在50 ℃烘干4 h后再次稱重。糞便含水量(%)=(濕重-干重)/干重×100%。

3.2腸通過時間檢測 小鼠禁食12 h，然后對小鼠進(jìn)行灌胃鋇餐(15% BaSO4，每只灌胃1.5 g)，隨后記錄第1次白色糞便排出時間。

3.3血清NO檢測 小鼠禁食12 h后，乙醚麻醉小鼠，摘掉眼球，通過眼眶取血，每只小鼠取血0.6 mL。血液在室溫靜置30 min，待血液凝固后，2 000×g離心5 min，收集血清。按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測血清中NO含量。待反應(yīng)結(jié)束后，通過酶標(biāo)儀檢測540 nm處吸光度(A)值，并根據(jù)預(yù)先制作的NO吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清中NO含量。

3.4結(jié)腸組織收集 乙醚過量麻醉處死小鼠后，分離小鼠結(jié)腸組織。組織分為兩部分，一部分凍存在-80 ℃冰箱，另一部分固定在4%福爾馬林緩沖液中，24 h后進(jìn)行石蠟包埋處理。

3.5HE染色 取小鼠結(jié)腸石蠟組織，經(jīng)石蠟切片機(jī)切為5 μm厚度的石蠟切片。切片在二甲苯中脫蠟，隨即在梯度乙醇中脫水，然后復(fù)水后，按照HE染色試劑盒說明書步驟，對結(jié)腸組織切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。

3.6免疫組化 小鼠結(jié)腸石蠟切片在二甲苯中脫蠟，隨即在梯度乙醇中脫水，在檸檬酸鹽煮沸后冷卻，加入山羊血清37 ℃封閉。在37 ℃條件下，切片用I抗VIPR1和5-HT4receptor(1 ∶500)孵育2 h。PBS沖洗切片3次，每次3 min，隨后在37 ℃條件下，用HRP標(biāo)記的IgG(1 ∶200)孵育1 h。PBS沖洗切片3次，每次2 min，用AB過氧化物酶(1 ∶200)染色45 min，用DAB溶液顯色5 min，蘇木精復(fù)染1 min。中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取3個視野，通過ImageJ軟件分析。

3.7Western blot實(shí)驗(yàn) 取小鼠結(jié)腸組織，經(jīng)常規(guī)勻漿后，用RIPA裂解液從結(jié)腸組織中提取總蛋白。使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每樣品取30 μg蛋白，經(jīng)煮沸變性后，進(jìn)行10%SDS-PAGE。電泳分離的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，隨后分別加入1抗(TRPV1 1 ∶500，GDNF 1 ∶500，BDNF 1 ∶1 000，NOS 1 ∶500，c-Kit 1 ∶1 500，SCF 1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的IgG II抗，在室溫下孵育1.5 h。TBST洗膜后，在暗室用ECL顯影液使得目的條帶形象化，然后曝光于膠片。采用Quantity One 軟件分析條帶的灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析。多組比較采用采用單因素方差分析(one-way ANOWA)并以Fisher′s最小顯著差異(least significant difference，LSD)法進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大黃素對便秘小鼠腸功能的影響

在排便觀察的2 h內(nèi)，與對照組比較，Lop組小鼠的排便次數(shù)和糞便含水量均顯著降低(P0.01)；與Lop組比較，Lop+大黃素組小鼠排便次數(shù)和糞便含水量均顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見圖1A、B。檢測糞便在腸通過時間的結(jié)果顯示，與對照組比較，Lop組小鼠腸通過時間顯著增加(P<0.01)；與Lop組比較，Lop+大黃素組小鼠腸通過時間顯著降低(P<0.01)，見圖1C。

Figure 1.Effect of emodin on intestinal function in Lop-induced constipation mice. A: statistical results of the defecation frequency within 2 h; B: statistical results of the fecal water content; C: statistical results of the gastrointestinal transit time. Mean±SEM. n=11 in control (Con) group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs Lop group.

2 大黃素對便秘小鼠結(jié)腸炎癥的影響

HE染色結(jié)果顯示，對照組腸絨毛排列整齊；Lop組腸絨毛排列紊亂，且有炎癥細(xì)胞侵潤，腸壁(箭頭)變??；Lop+大黃素組腸絨毛排列和腸壁趨向正常，炎癥細(xì)胞侵潤減少，見圖2。

Figure 2.Effect of emodin on the morphological changes of colon tissues in Lop-induced constipation mice (HE staining).

3 大黃素對便秘小鼠血清NO含量的影響

結(jié)果顯示，與對照組比較，Lop組小鼠血清中NO水平顯著增加(P<0.01)；與Lop組比較，Lop+emodin組小鼠血清中NO水平顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.Effect of emodin on the level of serum NO in Lop-induced constipation mice. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; **P<0.01 vs Lop group.

4 大黃素對便秘小鼠結(jié)腸組織中VIPR1和5-HT4受體表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與對照組比較，Lop組小鼠結(jié)腸組織中VIPR1表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，5-HT4受體表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與Lop組比較，Lop+emodin組小鼠結(jié)腸組織中VIPR1表達(dá)水平(P<0.01)顯著降低，5-HT4受體表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.Effect of emodin on the expression levels of VIPR1 and 5-HT4 receptor of colon tissues in Lop-induced constipation mice. Scale bar=50 μm. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; **P<0.01 vs Lop group.

5 大黃素對便秘小鼠結(jié)腸組織中腸神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，Lop組小鼠結(jié)腸組織中TRPV1和NOS表達(dá)水平均顯著增加(P<0.001)，GDNF和BDNF表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)；與Lop組比較，Lop+大黃素組小鼠結(jié)腸組織中TRPV1和NOS表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，GDNF和BDNF表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

Figure 5.Effect of emodin on the expression levels of enteric nerve-related factors of colon tissues in Lop-induced constipation mice. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; *P<0.05, **P<0.01 vs Lop group.

6 大黃素對便秘小鼠結(jié)腸組織中c-Kit和SCF表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，Lop組小鼠組織中c-Kit和SCF的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)；與Lop組比較，Lop+大黃素組小鼠結(jié)腸組織中c-Kit和SCF的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.Effect of emodin on the expression levels of c-Kit and SCF of colon tissues in Lop-induced constipation mice. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; **P<0.01 vs Lop group.

討 論

便秘是一種與排便異常相關(guān)的功能性胃腸道疾病。在我國，由于近年來生活節(jié)奏加快、飲食結(jié)構(gòu)改變和老齡化加快等因素，便秘的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加現(xiàn)象[7]。目前，臨床上常見的抗便秘藥物存在心血管不良的潛在風(fēng)險[4]。本研究結(jié)果顯示，大黃素能促進(jìn)便秘小鼠排便并增加糞便含水量，并且降低糞便在腸通過時間。這一結(jié)果提示，大黃素具有緩解便秘的作用。

便秘與腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)失調(diào)相關(guān)。在ENS中，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和NO等均是與胃腸道蠕動活性相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)[8-13]。5-HT屬于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可直接作用于結(jié)腸黏膜上腸嗜鉻細(xì)胞中5-HT4受體，引起腸道平滑肌收縮，促進(jìn)腸道蠕動引起排便[8]；VIP屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要支配結(jié)腸下行性反射，能與VIPR1結(jié)合促進(jìn)結(jié)腸階段性蠕動增加，這些腸段過度蠕動甚至痙攣會導(dǎo)致推進(jìn)型運(yùn)動減弱[9-10]。在本研究中，大黃素處理的Lop致便秘小鼠中5-HT4受體顯著增加，而VIPR1水平顯著降低。另外，VIP還能通過促進(jìn)靶細(xì)胞合成NO[11]。NO是ENS中非特異性抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，過量NO可通過擴(kuò)散方式進(jìn)入腸道平滑肌細(xì)胞，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而使腸道階段式平滑肌過度舒張，導(dǎo)致過度的腸階段性蠕動(腸痙攣)[12]。本研究觀察到Lop致便秘小鼠血清中NO含量升高，而大黃素處理后的Lop致便秘小鼠的血清NO含量趨向正常。這一結(jié)果說明，大黃素能降低便秘小鼠血清NO水平。NOS是內(nèi)源性NO生成的限速酶，抑制便秘小鼠腸組織中NOS的表達(dá)能減少NO過量生成，進(jìn)而緩解便秘[13]。因此，本研究進(jìn)一步檢測小鼠結(jié)腸組織中NOS的表達(dá)，結(jié)果顯示，大黃素可下調(diào)便秘小鼠結(jié)腸組織NOS的表達(dá)。這些結(jié)果提示，大黃素緩解便秘的作

用可能與降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃腸道起搏細(xì)胞，在ENS傳導(dǎo)中起重要作用，可將神經(jīng)信號傳遞至腸道平滑肌[14]。一項(xiàng)研究[15]表明，便秘患者ICC密度低于正常人，而ICC密度降低導(dǎo)致ICC自發(fā)節(jié)律性慢波作用喪失、結(jié)腸運(yùn)動紊亂。c-Kit及其配體SCF是ICC生長、發(fā)育和維持的主要因素[16]。據(jù)報道[17]，在便秘小鼠結(jié)腸中ICC密度、c-Kit以及SCF表達(dá)均降低。本研究顯示，大黃素可促進(jìn)便秘小鼠結(jié)腸組織中c-Kit和SCF表達(dá)。

BDNF也是ENS中重要的神經(jīng)因子，BDNF表達(dá)降低可使腸平滑肌繼發(fā)性變性進(jìn)而導(dǎo)致腸蠕動失常[18]。平滑肌細(xì)胞來源GDNF是影響ENS的重要因素，其表達(dá)減少或缺失會導(dǎo)致腸神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能紊亂[19]。本研究結(jié)果顯示，大黃素處理的Lop致便秘小鼠結(jié)腸組織中BDNF和GDNF水平顯著增加。

VIPR1還能抑制巨噬細(xì)胞活性和T細(xì)胞增殖[20]。巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞在炎癥浸潤過程中起重要作用。長期便秘可引起腸道便秘相關(guān)性損傷和炎性反應(yīng)。TRPV1的異常高表達(dá)正是腸道損傷的一個重要特征[21]。TRPV1是通過參與疼痛傳遞以及多種疼痛信號的整合來調(diào)節(jié)腸道蠕動[21]。過度激活TRPV1可誘導(dǎo)持續(xù)性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，導(dǎo)致胃腸運(yùn)動功能紊亂[21-22]。研究報道[22]，TRPV1高表達(dá)常見于便秘導(dǎo)致的腸道損傷患者。而GDNF表達(dá)的增強(qiáng)有助于修復(fù)受損的胃腸道，從而有助于避免或緩解便秘[18]。本研究觀察到，大黃素處理的Lop致便秘小鼠結(jié)腸組織中炎性浸潤和VIPR1、TRPV1表達(dá)均降低，GDNF表達(dá)水平增加。提示，大黃素抑制Lop致便秘相關(guān)的結(jié)腸炎癥和損傷的作用在一定程度上與抑制VIPR1和TRPV1表達(dá)水平和促進(jìn)GDNF表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，大黃素可能通過修復(fù)Lop導(dǎo)致的ENS失調(diào)來改善便秘小鼠腸道蠕動，減輕便秘相關(guān)結(jié)腸炎癥和便秘癥狀。