丙泊酚對人胃癌細胞SGC-7901侵襲和遷移能力的影響*

張志發(fā)， 龍 思， 吳婭琴， 王學(xué)仁

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院麻醉科， 湖北 武漢 430030)

惡性腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的主要因素之一。近年研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤術(shù)后發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移不僅與其自身的異質(zhì)性相關(guān)，也與圍術(shù)期麻醉藥物的使用有關(guān)。丙泊酚(propofol)是一種常用的靜脈麻醉藥，被廣泛應(yīng)用于各類腫瘤手術(shù)的誘導(dǎo)、維持以及術(shù)后ICU的鎮(zhèn)靜，其對腫瘤細胞生物學(xué)特性的影響亦引起較多的關(guān)注。目前研究報道丙泊酚對腫瘤細胞侵襲和遷移能力的影響具有雙向性，既具有抑制卵巢癌細胞侵襲能力的功能[1]，也具有促進膽囊癌細胞增殖和侵襲能力的特性[2]，甚至于對同一組織類型來源而分化程度不同的腫瘤細胞株的影響也不盡相同[3-4]。因此，丙泊酚對腫瘤細胞生物學(xué)特性的影響及機制值得深入的研究。較多的臨床研究證實，富半胱氨酸血管生成誘導(dǎo)因子61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)、CD44v6[5]和基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloprotei-nase-7,MMP-7)[6]3種分子與術(shù)后胃癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險密切相關(guān)，但丙泊酚是否影響上述3種蛋白的表達進而改變胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，目前尚不清楚。本研究以人胃癌細胞SGC-7901作為研究對象，探討臨床濃度的丙泊酚對其CYR61、CD44v6和 MMP-7的表達及體外侵襲和遷移能力的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901購自中科院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中添加1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，選用對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。DMSO溶解丙泊酚至所需濃度進行后續(xù)實驗。

2 主要試劑

RPMI-1640和胎牛血清(HyClone);丙泊酚(Sigma);DMSO(Sigma);兔抗CYR61抗體(CST);鼠抗CD44v6抗體和兔抗MMP-7抗體(Abcam)。酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)；Matrigel(BD)。

3 主要方法

3.1MTT法測定細胞活力 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以5×107/L細胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)置5個復(fù)孔。加入不同濃度(1、3、5和7 mg/L)丙泊酚處理，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h，隨后每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL并振蕩反應(yīng)10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測490 nm 處吸光度(A)值，計算細胞的相對活力。細胞相對活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

3.2細胞侵襲實驗 將稀釋后的Matrigel(每孔30 μL)平鋪于Transwell板上室中，37 ℃靜置3 h，制成凝膠備用。Transwell板下室中每孔加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，上室中每孔加入300 μL含不同濃度丙泊酚的無血清細胞懸液(細胞密度為1×108/L)。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，吸除培養(yǎng)液，擦拭小室上層未侵襲的細胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，將小室倒置，顯微鏡下觀察小室濾膜底下室附著的細胞，進行觀察并拍照。每組隨機選取5個視野，計數(shù)每一視野內(nèi)穿過膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3 次，每個實驗5個復(fù)孔。

3.3劃痕愈合實驗 以1×108/L的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%后，換無血清培養(yǎng)基同步化12 h。用1 mL槍頭在單層細胞上做線性劃痕，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3遍，每孔加入含不同濃度丙泊酚的完全培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察并拍照記錄劃痕寬度，記為0時劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在同一觀察點測量劃痕寬度，計算細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%，實驗重復(fù)3次，每個實驗5個復(fù)孔。

3.4Western blot實驗 丙泊酚處理細胞24 h后，加入適量的RIPA全裂解液裂解，提取細胞總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。在細胞總蛋白樣品中加入loading buffer，沸水使其充分變性。然后，用SDS-PAGE分離蛋白，經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、Ⅰ抗(CYR61抗體1∶1 000稀釋，CD44v6抗體1∶1 000稀釋，MMP-7抗體1∶600稀釋)及Ⅱ抗孵育雜交后進行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。以β-actin 為內(nèi)參照，對條帶進行灰度掃描，比較各蛋白的表達變化。

3.5細胞免疫組化 取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細胞密度至1×108/L。將無菌處理的蓋玻片均勻鋪于6孔板中，接種細胞懸液后培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入丙泊酚處理上述細胞24 h后取出蓋玻片進行免疫組化染色。PBS漂洗、4%多聚甲醛固定以及0.5% Triton X-100 37 ℃溫育后，3% H2O2作用15 min，滴加山羊血清工作液封閉，進行Ⅰ抗孵育(CYR61抗體1∶100稀釋，CD44v6抗體1∶500稀釋，MMP-7抗體1∶100稀釋)，放入濕盒4 ℃過夜，PBS清洗3遍，滴加生物素化Ⅱ抗工作液室溫孵育30 min，PBS 洗3 遍，滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片，以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞。結(jié)果判斷根據(jù)細胞染色程度積分與其所占百分比積分的乘積進行評分。染色強度計分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；在100倍鏡下任意選取10個視野，400倍鏡下在每一個視野中連續(xù)計數(shù)100個細胞，記錄其中陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分?jǐn)?shù)，取平均數(shù)后從0到4分評分?！?0%為0分；11%～30%為1分；31%～50%為2分；51%～70%為3分；≥70%為4分，兩者得分乘積0～3分判定為低表達，≥4分判定為高表達。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較用t檢驗，多組間用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丙泊酚對胃癌細胞SGC-7901活力的影響

各組細胞相對活力依次為：100%(對照組)、(95±8)%(DMSO組)、(87±6)%(1 mg/L組)、(90±7)%(3 mg/L組)、(87±9)%(5 mg/L組)和(66±11)%(7 mg/L組)；與對照組相比，7 mg/L丙泊酚抑制SGC-7901細胞活力(P<0.05)，見圖1。因此，后續(xù)實驗采取5 mg/L的濃度作為實驗濃度。

Figure 1.Effect of propofol on the viability of gastric cancer cell line SGC-7901. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

2 丙泊酚對胃癌細胞SGC-7901侵襲能力的影響

各組穿透小室膜底細胞數(shù)依次為：25±4(對照組)、22±3(1 mg/L組)、21±6(3 mg/L組)和15±2(5 mg/L組)；與對照組相比，5 mg/L丙泊酚組穿透膜底的細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of propofol on the invasion ability of gastric cancer cell line SGC-7901 (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 丙泊酚對胃癌細胞SGC-7901遷移能力的影響

SGC-7901細胞經(jīng)不同濃度丙泊酚處理24 h后，劃痕實驗結(jié)果顯示各組細劃痕愈合率分別為：(37.4±5.6)%(對照組)、(33.7±1.7)%(1 mg/L組)、(31.3±2.4)% (3 mg/L組)、(20.4 ±1.0)% (5 mg/L組)；與對照組相比，5 mg/L丙泊酚組愈合率顯著下降(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Effect of propofol on the migration ability of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

4 丙泊酚對胃癌細胞SGC-7901中CYR61、CD44v6和MMP-7表達的影響

SGC-7901細胞經(jīng)5 mg/L丙泊酚處理后，CYR61主要定位于細胞膜和近膜的胞質(zhì)，對照組與實驗組均呈低表達，極少數(shù)細胞呈散在棕黃色染色，兩組間未見明顯差異(P>0.05)；CD44v6主要表達于細胞膜，呈棕黃色散在分布，胞漿少量可見，對照組表達強度和比例高于實驗組(P<0.05)；MMP-7主要表達于細胞胞質(zhì)內(nèi)，棕色顆粒彌漫分布，對照組表達高于實驗組(P<0.05)，見圖4A。Western blotting結(jié)果與上述結(jié)果一致，見圖4B。

Figure 4.5 mg/L propofol suppressed the protein expression of CD44v6 and MMP-7 in gastric cancer cell line SGC-7901. A: detection of CYR61, CD44v6 and MMP-7 expression was performed by immunocytochemistry (×400); B: detection of CYR61, CD44v6 and MMP-7 expression was performed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可下調(diào)胃癌細胞SGC-7901 CD44v6和MMP-7蛋白的表達，并抑制其侵襲和遷移能力，初步證實了丙泊酚對胃癌細胞SGC-7901的抗腫瘤特性及相關(guān)分子機制。丙泊酚的血漿靶濃度約3～8 mg/L[7]，本研究以胃癌細胞SGC-7901為研究對象，發(fā)現(xiàn)5 mg/L丙泊酚可在不影響細胞活力的基礎(chǔ)上抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而7 mg/L丙泊酚則呈現(xiàn)抑制胃癌細胞SGC-7901活力的特性，是否會影響細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力尚待證實。

腫瘤細胞侵襲能力的改變多與介導(dǎo)細胞-細胞或細胞-間質(zhì)之間相互作用的黏附分子以及分泌降解細胞外物理屏障酶的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員有關(guān)，尤其是黏附分子CD44v6和MMP-7，其與胃癌的組織分型及侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。CD44v6為細胞黏附分子CD44 基因v區(qū)外顯子通過剪接后形成的拼接變異體，可改變腫瘤細胞表面黏附分子的結(jié)構(gòu)和功能，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。CD44v6與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及病理分期的密切關(guān)系，更是其判斷胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)[9]。另外，CD44v6-HA交聯(lián)反應(yīng)也可募集MMPs等特定的細胞因子，促進腫瘤細胞存活和轉(zhuǎn)移[10]。MMP-7作為MMPs家族中重要的亞型，可通過酶解作用克服細胞外基質(zhì)和多種細胞因子構(gòu)成的物理化學(xué)屏障，降解ECM成分導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。MMP-7作為MMPs家族中唯一在胃癌中存在差異表達的基因，表達越強，胃癌的惡性程度越高[12]。雖然一些研究報道了丙泊酚可通過調(diào)控MMPs家族某些亞型影響腫瘤細胞生物學(xué)特性，但目前尚未發(fā)現(xiàn)丙泊酚是否可直接調(diào)控MMP-7或通過MMP-7間接調(diào)控MMPs家族的其它亞型進而影響胃癌細胞的侵襲能力。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)5 mg/L丙泊酚處理胃癌細胞SGC-7901后，CD44v6和MMP-7的表達被抑制，推測丙泊酚導(dǎo)致侵襲能力下調(diào)的分子機制可能與這2個因素有關(guān)，但CD44v6是否通過與HA交聯(lián)的方式調(diào)控MMP-7的表達需要進一步的研究。

CYR61是一個由381個氨基酸組成的分泌蛋白，屬于CCN家族成員之一，在不同類型腫瘤中存在差異表達的現(xiàn)象，揭示其既具有癌基因的作用也能發(fā)揮抑癌基因的功能[13-14]。在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)其表達也存在不一致性，Wei等[15]發(fā)現(xiàn)在胃癌組織及細胞中高表達CYR61，整合素αvβ3/NF-κβ信號參與了其侵襲能力的調(diào)控[16]；而Maeta等[17]的研究則發(fā)現(xiàn)CYR61蛋白在共表達5-羥色胺、高侵襲性的胃癌細胞中低表達，且與MMP-7的表達存在負(fù)相關(guān)性，其機制可能與CYR61通過調(diào)控整合素αvβ1抑制FAK或E1AF的活化相關(guān)[18]。但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)5 mg/L 丙泊酚處理胃癌細胞SGC-7901對其CYR61的表達并無影響，也未見CYR61與MMP-7表達的相關(guān)性，推測其可能與該基因下游靶基因整聯(lián)蛋白以及細胞系的差異有關(guān)。

綜上所述，臨床相關(guān)濃度的丙泊酚可抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲和遷移能力，與抑制細胞活性無關(guān)，其機制可能與CD44v6/MMP-7等參與細胞黏附和基質(zhì)降解等過程的分子有關(guān)。