應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化抗體庫(kù)*

施黎銀， 周 輝， 趙 明△

(1南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 廣東 廣州 510515； 2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院, 廣東 廣州 510630)

當(dāng)今，心血管疾病逐年增高并越來(lái)越年輕化，而動(dòng)脈粥樣化則是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制至今仍在探索中，有多種學(xué)說(shuō)從不同角度對(duì)它進(jìn)行了闡述。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素作用的自身免疫性疾病，天然免疫和獲得性免疫均參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2]多種自身抗原參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。目前已證實(shí)的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的重要抗原，具有高免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生ox-LDL抗體。LDL在致氧因子的作用下氧化形成ox-LDL，ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白，進(jìn)而堆積形成泡沫細(xì)胞。ox-LDL引起的炎癥反應(yīng)還可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，從而刺激中膜平滑肌細(xì)胞及肌源性泡沫細(xì)胞遷移至內(nèi)膜，結(jié)合單核細(xì)胞上的Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TRL4)，激活單核細(xì)胞，導(dǎo)致大量泡沫細(xì)胞的形成[3]，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。

大量實(shí)驗(yàn)表明ox-LDL刺激機(jī)體產(chǎn)生的ox-LDL抗體[4]與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展有關(guān)。研究人員在雄性動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了ox-LDL抗體的滴度與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展呈正相關(guān)。第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的是E06(一個(gè)鼠IgM單克隆抗體)，其次是鼠單克隆IgG MDA2抗體[5]，經(jīng)過(guò)MRI的檢查，均證實(shí)了該抗體在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中確實(shí)起到了保護(hù)性作用。因此，用抗體來(lái)治療動(dòng)脈粥樣硬化成為一個(gè)新的研究方向。

目前篩選人源抗體應(yīng)用最廣泛的技術(shù)包括噬菌體抗體展示技術(shù)[6]和哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)主要是將抗體融合在絲狀噬菌體(filamentous phage)的外殼蛋白上，使抗體能夠表達(dá)在噬菌體顆粒表面。通過(guò)數(shù)輪對(duì)抗體的篩選和富集，即可獲得針對(duì)特定抗原的特異性單克隆抗體。但是，噬菌體展示技術(shù)不能篩選出全長(zhǎng)抗體，只能得到例如抗原結(jié)合片段(fragment of antigen binding, Fab)或單鏈可變區(qū)抗體片段(single chain variable fragment, scFv)等抗體片段[7]。而且抗體的表達(dá)和修飾過(guò)程是在細(xì)菌中進(jìn)行，如果將獲得的抗體基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，抗體要么無(wú)法表達(dá)，要么表達(dá)量極低。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究鎖定在利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)來(lái)獲得人源抗體[8]，它主要通過(guò)跨膜序列將全長(zhǎng)抗體展示在細(xì)胞表面，從而可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行高通量篩選得到與抗原結(jié)合的抗體。所以，應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)可展示全長(zhǎng)人源抗體，篩選得到的抗體的空間結(jié)構(gòu)與天然抗體結(jié)構(gòu)更為接近，全長(zhǎng)雙價(jià)抗體也可發(fā)揮抗體恒定區(qū)的效應(yīng)功能[9]。因此，本研究旨在構(gòu)建一個(gè)大容量的動(dòng)脈粥樣硬化抗體細(xì)胞庫(kù)，以此篩選得到具有治療作用的特異性的動(dòng)脈粥樣硬化抗體。

材 料 和 方 法

1 材料

本文中的外周血來(lái)自廣東省人民醫(yī)院心內(nèi)科12名年齡大于60歲的動(dòng)脈粥樣硬化患者，這12名均為已確診且需要行血管成形術(shù)和支架植入術(shù)的患者。載體pcDNA5/FRT、LipofectamineTM2000和Flp-InTM-CHO(FCHO)細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen;RNA提取試劑盒和DH5 α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買自北京天根生物技術(shù)有限公司；藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標(biāo)記的鼠抗人Kappa 鏈抗體購(gòu)自BD，DMEM和血清購(gòu)自HyClone，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)蠊荆琓aq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶SfiI、BsmB I購(gòu)自NEB；逆轉(zhuǎn)錄酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega；質(zhì)粒DNA回收試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；Hanm's-F 12培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies。

2 載體

載體pcDNA5/FRT包括CMV啟動(dòng)子，F(xiàn)LP重組酶(flippase，F(xiàn)lp)識(shí)別位點(diǎn)(flippase recognition target, FRT)，氨芐青霉素(ampicillin，Amp)和潮霉素(Hygromycin, hygro)抗性基因，見圖1。

Figure 1. Vector of pcDNA5/FRT.

3 方法

3.1分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mono-nuclear cells, PBMC) 抽取12名動(dòng)脈粥樣硬化患者靜脈血分離PBMC并提取總RNA(參照說(shuō)明書操作)，以總RNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物[10]逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

3.2構(gòu)建初級(jí)庫(kù)載體及二級(jí)庫(kù)雙表達(dá)載體pcDNA-DHL

3.2.1構(gòu)建載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK 首先PCR擴(kuò)增重鏈及跨膜序列(VH-TM)和輕鏈全長(zhǎng)(CK),再用限制性內(nèi)切酶XhoI和NheI酶切載體pcDNA5/FRT，利用重疊重組法分別將酶切后的載體和擴(kuò)增片段拼接形成新的載體。將上述連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，克隆鑒定后，分別命名為pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK，提質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2二級(jí)庫(kù)雙表達(dá)載體pcDNA-DHL構(gòu)建及驗(yàn)證 以載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK分別為模板，利用PCR擴(kuò)增出完整的HC-TM表達(dá)框、載體骨架和完整的Kappa表達(dá)框，通過(guò)重疊重組，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建出雙表達(dá)載體pcDNA-DHL，見圖2。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA-DHL的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，將僅轉(zhuǎn)染pcDNA5-CK的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，將不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA的作為空白對(duì)照。同時(shí)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA5-VH-TM + pcDNA5-CK的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞。

Figure 2.Vector of pcDNA5-DHL.

3.3 構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化抗體基因庫(kù)pDHL-As

3.3.1構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化全人源初級(jí)重鏈抗體庫(kù)pcDNA-vh和初級(jí)輕鏈抗體庫(kù)pcDNA-ck 以cDNA第1條鏈為模板，用相應(yīng)引物PCR擴(kuò)增抗體全套Kappa輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。用限制性內(nèi)切酶AgeI和XhoI酶切輕鏈全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及載體pcDNA5-CK，回收酶切后片段，用T4 DNA連接酶按3∶1 比例混合連接，在16 ℃反應(yīng)24 h后導(dǎo)入感受態(tài)DH5α，構(gòu)建輕鏈基因初庫(kù)pcDNA-ck。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌倍比稀釋，均勻涂在含100 mg/L 氨芐青霉素的LB固體平皿上，倒置于37 ℃孵箱12～18 h，計(jì)數(shù)平皿上的菌落數(shù)，并計(jì)算出輕鏈的庫(kù)容量。將平皿上的所有菌落收集起來(lái)，即為輕鏈抗體基因庫(kù)。以同樣的方法構(gòu)建重鏈基因初庫(kù)pcDNA-vh。分別從重、輕鏈抗體庫(kù)中各挑50個(gè)單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，小提質(zhì)粒，送華大基因測(cè)序并軟件分析序列。

3.3.2動(dòng)脈粥樣硬化二級(jí)抗體基因庫(kù)pDHL-As的構(gòu)建 用內(nèi)切酶SfiI酶切后可用于插入抗體輕鏈的全長(zhǎng)基因片段，用BsmB I酶切后可用于插入抗體重鏈的可變區(qū)基因片段。同時(shí)以BsmB I和SfiI對(duì)載體pcDNA-DHL進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并分離純化5 kb和3 kb的兩段目的片段。再用SfiI和BsmB I分別對(duì)前面制備好的輕鏈和重鏈基因初庫(kù)進(jìn)行酶切，進(jìn)行DNA的凝膠電泳分離純化備用。將上面獲得的2個(gè)載體片段、1個(gè)輕鏈全長(zhǎng)片段和1個(gè)重鏈可變區(qū)片段按1 ∶1 ∶ 3 ∶3分子比例混合，用T4DNA連接酶，16 ℃連接24 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌DH5α，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體平皿上，倒置于37 ℃孵箱12～18 h，計(jì)數(shù)平皿上的菌落數(shù)，并計(jì)算出庫(kù)容量。

3.3.3抗體基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Flp-InTM-CHO細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Flp-InTM-CHO細(xì)胞以每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔板中，12 h后換新鮮培養(yǎng)基。4 μg混合質(zhì)粒(0.4 μg PDHL質(zhì)粒+3.6 μg poG44質(zhì)粒加入250 μL opti-MEM培養(yǎng)基中，充分混勻后往里加8 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，混勻室溫放置20 min，將混合物加入對(duì)應(yīng)的6孔板中，4 h后換液并培養(yǎng)48 h，加入含500 mg/L潮霉素培養(yǎng)基加壓篩選，每2天換1次液，篩選2周后收集生長(zhǎng)狀態(tài)好的活細(xì)胞保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4抗ox-LDL抗體的篩選及初步鑒定 我們選擇ox-LDL作為抗原來(lái)篩選出特異性抗體。根據(jù)FITC標(biāo)記試劑盒的說(shuō)明書，用FITC標(biāo)記ox-LDL，常規(guī)培養(yǎng)動(dòng)脈粥樣硬化抗體細(xì)胞庫(kù)，用不含胰酶的細(xì)胞消化液進(jìn)行消化回收后用PE標(biāo)記鼠抗人抗體和FITC標(biāo)記ox-LDL進(jìn)行雙染，隨后經(jīng)流式細(xì)胞分選儀檢測(cè)、分選表達(dá)抗ox-LDL抗體的FCHO細(xì)胞。

結(jié) 果

1 外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA的提取

抽取動(dòng)脈粥樣硬化患者的外周血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出PMBC。按TRIzol試劑說(shuō)明書操作，提取總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性，做了3個(gè)批次，可見3條清晰的28 s、18 s和5 s條帶，說(shuō)明提取的總RNA完整性較好，見圖3。

Figure 3.Total RNA extracted from PBMCs.Three different batches. M: Marker; 1～3: 3 different batches.

2 PCR擴(kuò)增重鏈及跨膜序列(VH-TM)片段和輕鏈全長(zhǎng)(CK)

PCR擴(kuò)增得到的VH-TM長(zhǎng)約為1 600 bp， CK約為800 bp左右，分別連接至載體pcDNA-FRT，構(gòu)建載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK，見圖4。

Figure 4.PCR results for constructed fragmentVH-TM and fragment CK. A: 1～4 PCR amplification of the genes fragment of VH-TM；B: 1～6 PCR amplification of the genes fragment of CK. M: marker.

3 雙表達(dá)載體pcDNA-DHL的酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶sfiI、BsmB I酶切驗(yàn)證重組載體pcDNA-DHL是否正確，酶切后片段大小各為800bp、4 900 bp、400 bp、2 700 bp，見圖5。

Figure 5.The vector pcDNA-DHL digested by Sfi I and BsmB I. We get four fragments. M: Marker; 1～2: two identical samples.

4 二級(jí)雙表達(dá)載體pcDNA-DHL在293F細(xì)胞表面展示

雙表達(dá)抗體基因庫(kù)(pcDNA-DHL)轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀分析全長(zhǎng)抗體庫(kù)在293F細(xì)胞表面的展示，結(jié)果顯示，用pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK共轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞可以檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞總量為27%，見圖6B，轉(zhuǎn)染了pcDNA-DHL的293F細(xì)胞可以檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞總量為39.2%，見圖6D。說(shuō)明全長(zhǎng)抗體可以成功地展示在293F細(xì)胞的表面。

Figure 6.FACS analysis of antibody library expression on 293F cell surface.A: negative control (non- transfected 293F cells); B:positive control (pcDNA5-VH-TM and pcDNA5-CK co-transfected 293F cells); C: 293F cells transfected with pcDNA5-CK and labeled with PE-Kappa；D: 293F cells transfected with pcDNA-DHL and labeled with PE-Kappa.

5 抗體基因的擴(kuò)增

將重鏈可變區(qū)(VH)產(chǎn)物和輕鏈(CK)基因產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳中可見約0.38 kb的重鏈可變區(qū)條帶和0.70 kb Kappa輕鏈條帶，為目標(biāo)條帶，見圖7。

Figure 7.PCR amplification of the genes encoding the light and heavy chains of human antibodies. A: heavy chain variable region; B: Kappa chain. 1～7: 7 different batches. M： Marker.

6 輕、重鏈抗體初庫(kù)的構(gòu)建，庫(kù)容量的計(jì)算與測(cè)序結(jié)果分析

將酶切后的重、輕鏈PCR產(chǎn)物，分別插入載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK，并導(dǎo)入感受態(tài)DH5α。計(jì)數(shù)在帶有氨芐青霉素抗性的LB固體平皿上的菌落數(shù)，即可計(jì)算出所構(gòu)建的抗體基因初庫(kù)容量。結(jié)果顯示，重鏈基因初庫(kù)容量為1.79×105，輕鏈基因初庫(kù)容量為1.80×105。分別隨機(jī)挑選出50個(gè)輕鏈單克隆和50個(gè)重鏈單克隆，進(jìn)行測(cè)序分析。再分別從重鏈輕鏈的50個(gè)克隆中挑選出20個(gè)測(cè)序結(jié)果分析，結(jié)果如圖所示，20個(gè)重鏈克隆中有16個(gè)克隆含有正確的閱讀框架；20個(gè)輕鏈克隆有18個(gè)克隆含有正確的閱讀框架。理論上抗體庫(kù)多樣性為2.32×1010[(1.79×105×80%)×(1.8×105×90%)]，見圖8。

Figure 8.Analysis for the sequences of the regions of the healy chains (A) and light chains (B).

7 動(dòng)脈粥樣硬化抗體基因庫(kù)的構(gòu)建

酶切后的重、輕鏈初庫(kù)產(chǎn)物，酶切后的載體pcDNA-DHL片段，利用四片段連接法連接后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α。計(jì)數(shù)在含有氨芐青霉素抗性的LB固體平皿上的菌落數(shù)，即可獲得所構(gòu)建的抗體基因庫(kù)容量。結(jié)果顯示雙表達(dá)抗體基因庫(kù)容量為1.81×105。

8 全長(zhǎng)抗體在Flp-InTM-CHO細(xì)胞表面的表達(dá)

將抗體庫(kù)質(zhì)粒DNA與質(zhì)粒poG44共轉(zhuǎn)染Flp-InTM-CHO細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀分析抗體在Flp-InTM-CHO表面的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，17.1%的細(xì)胞表面可檢測(cè)到抗體的表達(dá)，見圖9。

Figure 9.Flow cytometry for detecting the expression of human antibodies on Flp-InTM-CHO cell surface.

9 抗ox-LDL抗體的篩選及初步鑒定

用PE標(biāo)記的鼠抗人抗體和FITC標(biāo)記的ox-LDL進(jìn)行雙染，隨后經(jīng)流式細(xì)胞分選儀分選出45個(gè)表達(dá)抗ox-LDL抗體的FCHO細(xì)胞，見圖10。

Figure 10.The PE and FITC double positive cells were sort by flow cytometry. A: control; B: treatment.

討 論

血管內(nèi)的免疫反應(yīng)可致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生已被廣泛接受，科學(xué)家們便研究是否可以利用這方面的知識(shí)來(lái)開發(fā)治療心血管疾病的新方法。ox-LDL也成為研究熱門的靶點(diǎn)之一，其中之前研究較為深入的ox-LDL治療抗體BI-206，已在小鼠[11]和恒河猴[12]等動(dòng)物模型中展示了對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的良好治療效果，但在2015年的二期臨床試驗(yàn)(使用)結(jié)果中卻無(wú)明顯療效。其中的潛在的原因可能是因?yàn)檫@個(gè)抗體是在從單鏈抗體噬菌體庫(kù)(n-CoDeR)篩選出來(lái)的，使用的是噬菌體展示技術(shù)。由于篩選過(guò)程是在細(xì)菌中進(jìn)行，原核表達(dá)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)存在一定差異，抗體的空間結(jié)構(gòu)未必與天然抗體結(jié)構(gòu)相似，故篩選出的抗體在后續(xù)應(yīng)用中可能存在一定劣勢(shì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)可展示全長(zhǎng)人源抗體，篩選到的抗體空間結(jié)構(gòu)與天然抗體結(jié)構(gòu)更為接近，在動(dòng)物、臨床研究中的治療效果應(yīng)該更具優(yōu)勢(shì)，故本研究使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)篩選ox-LDL抗體。

為保證抗體庫(kù)的特異性，選擇的PBMCs來(lái)源于大于60歲的動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血。其次，為保證PBMCs中抗體基因的完整性，減少特異性抗體基因的丟失，提取RNA后檢測(cè)RNA質(zhì)量符合要求方可進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外構(gòu)建雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pcDNA-DHL的目的是一次性同時(shí)轉(zhuǎn)入輕鏈和重鏈載體，減少因多次轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的同一個(gè)CHO細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)輕鏈載體或重鏈載體。本研究通過(guò)改造載體pcDNA5-FRT，使得我們構(gòu)建的二級(jí)雙表達(dá)載體上帶有FRT位點(diǎn)和潮霉素抗性基因。我們同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT和poG44兩個(gè)質(zhì)粒，poG44會(huì)表達(dá)Flp重組酶，pcDNA5/FRT帶有目的基因。在Flp重組酶的催化下，pcDNA5/FRT上的FRT位點(diǎn)和染色體上已經(jīng)存在的FRT位點(diǎn)發(fā)生重組，將質(zhì)粒上的目的基因重組到細(xì)胞染色體上，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的組成型表達(dá)。經(jīng)過(guò)潮霉素的篩選和淘汰[13]，從而實(shí)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞展示一種抗體。雙表達(dá)載體pcDNA-DHL中抗體基因表達(dá)結(jié)構(gòu)包含啟動(dòng)子、FLP重組酶識(shí)別位點(diǎn)FRT及血小板衍生生長(zhǎng)因子受體跨膜序列(plateletderived growth factor receptor trans- membrane,PDGFR-TM)。載體重鏈尾部加上跨膜序列TM，使抗體可以展示在細(xì)胞膜表面。再用流式進(jìn)行抗體庫(kù)的篩選，抗輕鏈抗體標(biāo)記，即可獲得全長(zhǎng)抗體在細(xì)胞表面的表達(dá)情況[14]。

利用此抗體庫(kù)，用ox-LDL作為抗原，篩選出了45個(gè)跟ox-LDL親和力高的細(xì)胞，接下來(lái)，我們將從這45個(gè)細(xì)胞里篩選出可穩(wěn)定表達(dá)抗體的單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)，表達(dá)抗體，以供后續(xù)的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。由于抗體片段與載體連接效率，細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率等步驟的實(shí)際操作存在限制，導(dǎo)致抗體庫(kù)的容量局限在105左右，因而，本研究可以選擇電轉(zhuǎn)化來(lái)提高轉(zhuǎn)化效率，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上提高連接效率等，篩選出更大庫(kù)容量的抗體庫(kù)。