珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂) 幼魚潰瘍病病原分離及鑒定分析

王寶珍，葛 輝

(1.福建省晉江市海洋與漁業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，福建 晉江 362200；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

珍珠龍膽石斑魚，俗稱龍虎斑或珍珠斑，是由鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus，俗稱龍膽斑，父本)和棕點(diǎn)石斑魚(E.fuscoguttatus，俗稱老虎斑，母本)雜交培育的新品種。養(yǎng)殖實(shí)踐表明，珍珠龍膽石斑魚具有雜交優(yōu)勢，不僅將鞍帶石斑魚生長速度快和棕點(diǎn)石斑魚抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)集于一身，而且肉質(zhì)細(xì)膩，營養(yǎng)價(jià)值高，已逐漸成為石斑魚養(yǎng)殖的寵兒[1]。但近年來，隨著高密度養(yǎng)殖技術(shù)推廣、水環(huán)境污染、疾病防控不足等諸多因素影響，珍珠龍膽石斑魚病害頻繁發(fā)生。

2018年1月30日，廈門小嶝水產(chǎn)有限公司工廠化養(yǎng)殖的珍珠龍膽石斑魚幼魚(10 cm左右)出現(xiàn)“潰瘍病”，10 d內(nèi)累計(jì)死亡率超過20，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文以患潰瘍病珍珠龍膽石斑魚幼魚為研究對象，分離致病菌株，采用形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA鑒定、生理生化特征等方法進(jìn)行菌株綜合鑒定。研究結(jié)果將為石斑魚潰瘍病的防治和健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，減少養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

患潰瘍病的珍珠龍膽石斑魚幼魚和用于人工感染實(shí)驗(yàn)的健康珍珠龍膽石斑魚均取自廈門小嶝水產(chǎn)科技有限公司養(yǎng)殖場，充氧帶回實(shí)驗(yàn)室。

病魚規(guī)格7～10 cm。病魚癥狀為活力較差、攝食力下降甚至不攝食、體表出血、皮膚潰爛。

健康珍珠龍膽石斑魚幼魚，平均體長約7 cm，平均體重約9 g，共60尾。暫養(yǎng)于50 L玻璃缸中，充氣，水溫27～28℃，鹽度25，早晚各投喂一次人工配合飼料，每天換水兩次，換水量為水體的1/3，暫養(yǎng)一周后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。

1.2 病原菌分離鑒定

1.2.1 病魚觀察鏡檢及神經(jīng)壞死病毒RT-PCR檢測

觀察并記錄病魚的主要病癥后，取病魚的鰓、體表黏液、病灶組織和內(nèi)臟組織在顯微鏡下檢查有無寄生蟲和真菌。取眼組織，提取RNA，按照魚類神經(jīng)壞死病毒(VNN)診斷技術(shù)規(guī)程(SC/T 7216—2012)，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測患病魚是否感染神經(jīng)壞死病毒。

1.2.2 細(xì)菌的分離、純化和保種

無菌取病魚體表潰瘍病灶處肌肉深部和心臟部位組織，劃線接種于2216E固體培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基上，28℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，不同部位做好標(biāo)記編號。觀察菌落形態(tài)特征，挑選形態(tài)一致的優(yōu)勢菌進(jìn)一步純化培養(yǎng)。挑取純化后優(yōu)勢菌株的單菌落，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)14 h后，在保種管加入0.5 mL菌液和0.5 mL 30%甘油混合，于-80℃冰箱保存保種。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察

取保種菌液50 μL涂布于TCBS培養(yǎng)基上，在 28℃ 恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落進(jìn)行涂片、固定，革蘭氏染色后鏡檢觀察。革蘭氏染色試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2.4 16S rDNA鑒定

挑取單菌落放入裝有10 μL ddH2O的PCR管中，99℃金屬浴加熱10 min， 12 000 rpm 離心5 min，取1 μL上清液作PCR模板，進(jìn)行16S rDNA鑒定。PCR擴(kuò)增引物為：27F( 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R( 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反應(yīng)體系為：1 μL 細(xì)菌DNA，引物各1 μL，12.5 μL 2×Taq Plus PCR MasterMix及9.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，30循環(huán)；最后72℃溫育10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，回收目的片段送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對和分析，用MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定所測菌株的種類。DNA marker DL2501購自上海捷瑞生物工程有限公司、PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.5 分離菌株的生理生化測定和藥物敏感性特征

生理生化的測定和藥敏實(shí)驗(yàn)按照VITEK 2 compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化流程操作。使用的鑒定卡為GN(革蘭氏陰性桿菌)鑒定卡和GN09(革蘭氏陰性菌)藥敏卡。

1.3 人工感染實(shí)驗(yàn)

采用腹腔注射、肌肉注射2種方法對暫養(yǎng)一周后的健康珍珠龍膽石斑魚幼魚進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，設(shè)置腹腔注射組、腹腔對照組、肌肉注射組和肌肉對照組，每組5尾，各設(shè)置3個(gè)平行組。菌液組每尾注射50 μL 5.4×106cfu/mL菌液，對照組每尾注射50 μL無菌生理鹽水。注射后將魚放回缸里，每天觀察實(shí)驗(yàn)魚的活力和攝食情況，記錄每組魚的發(fā)病癥狀和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 病癥觀察、鏡檢及RT-PCR檢測結(jié)果

患病珍珠龍膽石斑魚幼魚體表有明顯的皮膚潰爛癥狀(圖1)，鏡檢未發(fā)現(xiàn)寄生蟲和真菌；RT-PCR病毒檢測結(jié)果為陰性，說明患病魚未感染神經(jīng)壞死病毒。

2.2 分離純化

從病魚體表病灶肌肉深處和心臟組織中均分離到細(xì)菌，且從這兩個(gè)部位所分離出的優(yōu)勢菌落形態(tài)相似，在2216E固體培養(yǎng)基上分離的優(yōu)勢菌為白色、圓形、表面光滑、邊緣規(guī)則，TCBS培養(yǎng)基上分離的優(yōu)勢菌為黃色、圓形、表面光滑、邊緣規(guī)則。

2.3 細(xì)菌鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)分離菌株形態(tài)為紅色、兩端鈍圓的短桿狀(圖2)，該菌株為革蘭氏陰性桿菌。

2.3.2 16S rDNA鑒定

16S rDNA PCR獲得1個(gè)目的片段，約1 500 bp(圖 3)，將測序結(jié)果在 NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行 BlAST 比對分析，結(jié)果表明該菌與哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)的相似性最高，超過99%。用MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)菌株HW2018與哈維氏弧菌聚為一簇，親緣關(guān)系最近，證明菌株HW2018為哈維氏弧菌。

注：1.Marker DL2501；2.菌株HW2018擴(kuò)增片段。
Notes：1.Marker DL2501；2.The amplification fragment of the strain HW2018.

2.3.3 分離菌株的生理生化特征

生理生化檢測結(jié)果表明，該菌株L-脯氨酸芳胺酶、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶、D-海藻糖、磷酸酶呈陽性(表1)。

表1 菌株HW2018的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the strain HW2018

注：+：反應(yīng)陽性；-：反應(yīng)陰性。
Note：+ was positive ，-was negative.

2.4 分離菌株的藥物敏感性特征

藥敏分析結(jié)果顯示，哈維弧菌HW2018對多種抗生素敏感，對碳青霉烯類的美羅培南、氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星尤為敏感，而對氨芐西林耐藥(表2)。

表2 菌株HW2018的藥物敏感性特征Tab.2 Antibiotic susceptibilities of the strain HW2018

注：R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感。
Note：R was presistance，I was intermediary，S was sensitivity.

2.5 人工感染實(shí)驗(yàn)

人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對照組的魚活力和攝食情況明顯比菌液組的魚好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對照組魚攝食正常，有搶食現(xiàn)象，活力很好。腹腔菌液組和肌肉菌液組注射后第3天開始均有魚死亡，一周內(nèi)全部死亡，結(jié)果見表3；且腹腔注射處和肌肉注射處體表均出現(xiàn)發(fā)白潰爛癥狀(圖5)。菌液注射組魚全部死亡，發(fā)病潰爛癥狀與原始病魚相似，生理鹽水對照組魚無死亡，說明菌株HW2018是珍珠龍膽石斑魚潰爛死亡的致病菌。

表3 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of artificial infection experiment

續(xù)表3

注：A.腹腔注射組；B.肌肉注射組。
Notes：A.Celiac injection group；B.Muscle injection group.

3 討論

石斑魚是目前福建、廣東、海南等省海水養(yǎng)殖魚類的主要品種之一。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，皮膚潰瘍病已成為石斑魚育苗和養(yǎng)殖過程中的常見疾病之一。研究表明，石斑魚皮膚潰瘍病的病原菌主要為弧菌，其中哈維氏弧菌報(bào)道的最多[2-13]。王雪惠等[9]研究表明哈維氏弧菌是天津地區(qū)海水工廠化養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚潰瘍病的主要條件致病菌；崔靖等[12]對華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類主要弧菌病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，分離到43株哈維氏弧菌，且有19株為毒力菌。許悅等[13]對海南地區(qū)養(yǎng)殖石斑魚潰瘍病進(jìn)行調(diào)查，分離到9株哈維氏弧菌，認(rèn)為目前海南地區(qū)養(yǎng)殖石斑魚皮膚潰瘍病的致病原有較高的同一性，主要為哈維氏弧菌。這些研究表明哈維氏弧菌已成為我國南方各地海水養(yǎng)殖過程中危害最大的細(xì)菌性病原[6-8，10-14]。本文分離得到的菌株HW2018經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化以及16S rDNA 基因序列比對，將該菌株鑒定為哈維氏弧菌，也印證了這一觀點(diǎn)。

崔靖等調(diào)查結(jié)果表明，海南石斑魚潰瘍病的爆發(fā)時(shí)間多為4—10月[14]；許悅等調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在海南地區(qū)的11—12月，養(yǎng)殖石斑魚仍會(huì)發(fā)生大規(guī)模的皮膚潰瘍病[13]。本文珍珠龍膽石斑魚幼魚潰瘍病發(fā)生在1月底，與其他學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)的發(fā)病時(shí)間存在差異，分析認(rèn)為可能是由于該實(shí)驗(yàn)珍珠龍膽石斑魚采取工廠化養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖密度較高所致。

通過藥敏實(shí)驗(yàn)先確定病原菌的敏感藥物種類，可以更好地防治哈維氏弧菌病，以便正確使用水產(chǎn)藥物控制病害，避免頻繁使用藥物或?yàn)E用藥物而引起耐藥性。許悅等[13]研究表明，對哈維氏弧菌病的治療不能僅關(guān)注于皮膚潰爛、爛尾等外觀癥狀，應(yīng)采用浸浴給藥和配合口服給藥的方式來對其進(jìn)行系統(tǒng)的治療。本研究的藥敏實(shí)驗(yàn)表明，菌株HW2018對17種抗菌藥物表現(xiàn)出敏感性，其中對碳青霉烯類的美羅培南、氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星尤為敏感，而對氨芐西林耐藥。但是哈維弧菌的藥敏性可能因區(qū)域、菌株類型等因素的不同而存在差異[8，10，13，15]，因此在實(shí)際養(yǎng)殖過程中應(yīng)根據(jù)不同養(yǎng)殖條件進(jìn)行藥物選擇。

哈維氏弧菌是一種條件致病菌。因此，在實(shí)際養(yǎng)殖過程中應(yīng)以預(yù)防為主，減少魚的搬運(yùn)而避免產(chǎn)生體表損傷，合理規(guī)劃放養(yǎng)密度，減少水質(zhì)污染，增強(qiáng)魚體免疫力，調(diào)控好水溫。發(fā)生病害要迅速做出反應(yīng)，在最短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行治療；被感染的魚要及時(shí)隔離，阻止和降低潰瘍病的傳播。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從廈門小嶝水產(chǎn)科技有限公司工廠化養(yǎng)殖的患潰瘍病的珍珠龍膽石斑魚幼魚中分離到一株優(yōu)勢菌HW2018，經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化以及16S rDNA 基因序列比對，將該菌株鑒定為哈維氏弧菌。人工感染實(shí)驗(yàn)表明，該菌能引起健康珍珠龍膽石斑魚幼魚潰爛和死亡。藥敏分析結(jié)果顯示，哈維弧菌HW2018對多種抗生素敏感，對碳青霉烯類的美羅培南，氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星尤為敏感，而對氨芐西林耐藥。