電刺激獲得觀賞螯蝦天空藍魔精莢條件的優(yōu)化

洪 偉，王國棟,2*，宋紫玉，譙江華

(1.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021；2.農(nóng)村農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

天空藍魔是一種觀賞螯蝦，學名為Cheraxdestructor，是Cheraxdestructor人工培育獲得藍體色變異的俗稱。Cheraxdestructor分類上屬十足目蜊蛄科螯蝦亞科破壞者Destructor亞屬，原產(chǎn)于美國或西澳洲[1]。天空藍魔具有通體鮮亮的藍色和一對霸氣的大螯，體型較大，觀賞價值高，深受水族愛好者喜愛。因其生性好斗，死亡率高，親本交配率低，育苗產(chǎn)量少，市場供不應求[2-3]。天空藍魔的人工繁殖技術瓶頸有待突破。天空藍魔具開放式納精囊，屬開放式納精囊繁殖類型。同屬開放式納精囊繁殖類型的凡納濱對蝦人工授精已取得成功[4]，相關技術比較成熟，為天空藍魔實現(xiàn)人工授精、突破繁殖技術瓶頸提供了有益的參考。而人工獲取精莢是實現(xiàn)人工授精的關鍵一步[3]。

目前，人工獲取天空藍魔精莢方法，大致有解剖法[5]、擠壓法[6- 7]、電刺激法[8]等。其中電刺激獲取精莢的方法已經(jīng)被多數(shù)學者所認可，獲取的精莢及精莢內(nèi)的精細胞形態(tài)正常，雄蝦死亡率低，且電激采精的雄蝦還可多次成熟、重復采精，明顯優(yōu)于其他獲取方法[8]。Jerry[9]已經(jīng)使用電刺激成功獲取天空藍魔的精莢。本文通過電刺激雄性天空藍魔第五步足基部生殖孔前后，在不損傷蝦體可排出精莢前提下獲取精莢，對刺激電壓、頻率、持續(xù)刺激時間等條件進行優(yōu)化。

1 實驗材料與方法

1.1 親蝦培育

實驗室自養(yǎng)的人工天空藍魔，于2018年9月產(chǎn)出，共2缸(50～80尾/缸)，喂養(yǎng)血蟲，7～9月齡分離用于試驗。

天空藍魔親蝦用圓筒狀網(wǎng)籠(直徑10 cm，高40 cm)相互隔離，吊掛在規(guī)格為1.5 m×0.7 m×0.7 m水槽中。網(wǎng)籠上緣離水面10 cm以防止螯蝦攀爬。水溫(22.5±2.0)℃，pH 7.2～7.5，水體溶解氧高于5 mg/L。每日換水量為1/3，飽食性投喂冰鮮南極磷蝦肉。

本次試驗用于優(yōu)化的天空藍魔親蝦37尾，體長(6.1±0.8)cm、體重(13.3±1.2)cm。其中最小規(guī)格為體長5.2 cm、體重11.6 g，最大的規(guī)格為體長18.6 cm、體重76.23 g。

1.2 電刺激獲取精莢操作方法

試驗前，將雄性天空藍魔放置10℃左右的水中，降低其活動能力。設置生理多用儀(YSD-4G，安徽正華生物儀器設備有限公司)相應的參數(shù)后，將活動能力降低的雄性個體固定。將正極置于雄蝦一側(cè)的第五步足基部生殖孔前，負極置于同側(cè)的第五步足基部生殖孔后[8]。

打開控制開關，進行電刺激后，雄性可能雙側(cè)生殖孔都排出精莢，也可能只有一側(cè)排出精莢或沒有排出精莢。排出的精莢有些是完全排出，有些只排出部分。統(tǒng)計精莢排出的情況，并將精莢收集在1.5 mL離心管中備用。試驗后將天空藍魔放回原處繼續(xù)培養(yǎng)。

為了便于描述，將統(tǒng)計情況進行了如下定義，精莢完全排出為電刺激后精莢完全排出或用眼科鑷夾住精莢基部全部取出。精莢不完全排出指電刺激后精莢僅排出小部分，借助眼科鑷尚無法夾出。一尾螯蝦具有兩個精莢。

精莢排出率=[獲取精莢數(shù)/(試驗尾數(shù)×2)]×100%

精莢完全排出率=[精莢完全排出數(shù)/(試驗尾數(shù)×2)]×100%

精莢不完全排出率=[精莢不完全排出數(shù)/(試驗尾數(shù)×2)]×100%

1.3 精莢顯微觀察

將獲取的精莢，放在載玻片上，在倒置顯微鏡(XD-202，南京瑞元光學儀器有限公司)直接觀察精莢，并采用EZ-MET.Ink軟件拍照。

1.4 精莢內(nèi)精子數(shù)量測算

將電刺激獲取的精莢放入1.5 mL離心管中，加入1 mL 100%分析純乙醇固定24 h。2 000 rpm離心(5418R，德國艾本德公司)5 min，舍棄上清液，加入200 μL精莢溶解液(4.0 g蛋白酶K+ 0.6 g NaCl+100 mL滅菌水)，每隔1 h搖勻直至完全溶解，吸取800 μL PBS緩沖液(pH=7.0)制成1mL精子細胞溶液。將其過300目篩絹去除大顆粒沉淀，吸取1 μL PI工作液(碘化丙啶，10 μg/L)，室溫遮光染色40 min，使用流式細胞儀(A00-1-1102，貝克曼庫爾商貿(mào)有限公司)檢測分析精莢內(nèi)精子細胞數(shù)量。

公式中，顆粒數(shù)是流式細胞儀分析時獲得的陽性顆粒數(shù)；樣本流速為流式細胞儀進樣的速度；時間為進樣時間；樣本總量為精莢溶解后的總體積。

2 實驗結果與分析

2.1 電刺激條件的初步確定

當電壓為0～25 V時，電刺激親蝦無反應，當電壓為30 V時，可以電出精莢。當電壓為60 V時，電刺激部位會被灼傷，表現(xiàn)為刺激部位立即燒焦或幾天后刺激部位出現(xiàn)黑色肉坑。一旦灼傷，蛻殼多次都難以恢復。因此，將電壓范圍控制為30～55 V。為了避免親蝦的機體損傷，大于60 V的電壓刺激在水中進行，刺激部位同離水刺激，這時親蝦不排出精莢，蝦體劇烈抽搐，并且排糞，沒有死亡現(xiàn)象。

研究表明，在5～10 mA、40～50 Hz的條件下，可獲取精莢[8]。由于生理多用儀頻率輸出不可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此頻率設置為32 Hz和64 Hz調(diào)節(jié)。在此頻率下電壓為30～55 V時，可刺激排出精莢。改變頻率后，未發(fā)現(xiàn)結果產(chǎn)生變化，因此將頻率調(diào)為32 Hz。

當電刺激時間為2 s時，親蝦活動容易造成接觸時間不夠，影響精莢排出。4 s就可以較好避免這種情況，8 s、16 s與4 s沒有明顯差異。因此電刺激時間設置為4 s。

2.2 電壓條件優(yōu)化

表1 不同電壓下精莢排出率Tab.1 Electrical rate of spermatophore under different voltages

由表1可知，當頻率固定為32 Hz時，電壓在30～45 V的范圍內(nèi)，電壓與精莢排出率正相關。當電壓為45 V時，精莢完全排出率最高。當電壓值為50～55 V時，精莢排出率高，且精莢排出的速度很快，但會灼傷電刺激部位，且其完全排出率低于45 V的。

2.3 精莢的形態(tài)

當優(yōu)化的條件確定，將獲取的完整精莢，放置于載玻片上，滴加無菌水后直接觀察。肉眼觀察為白色絲狀聚集物，可拉伸為直線，具有較強的黏性，遇水后，呈膠狀，黏性消失。精莢的顯微結構如圖1所示，精莢為連續(xù)的管狀結構，此稱精莢小管，通過一種粘膠狀的基質(zhì)將精子包圍其中[8]；在精莢小管內(nèi)含多個精子，可見液體在精莢內(nèi)流動。

2.4 精莢內(nèi)精子數(shù)量

表2 精莢所含精子數(shù)量Tab.2 Sperm counts in spermatophores

當優(yōu)化的條件確定，選取最大規(guī)格48月齡父本螯蝦、7～9月齡螯蝦進行試驗獲取精莢。由表2可知，單個精莢內(nèi)精子數(shù)量在5.2×104～1.13×106個之間，同一尾雄蝦不同側(cè)生殖孔中排出的精莢中精子數(shù)量，無明顯差異；可能存在體重增大精子數(shù)量增多的關系。

3 討論

3.1 電刺激條件的初步確定及優(yōu)化

與解剖法、擠壓法相比，電刺激法不失為一種較安全可靠采取成熟精莢的方法。只要摸索出適宜的條件，刺激后的親蝦可繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)間隔采精。幾種對蝦電刺激采精的適宜條件為交流電壓4～6 V，刺激時間1～2 s[6]，其電壓明顯低于本文的結果。螯蝦具有較厚的甲殼，能較好地阻絕電流，這可能是天空藍魔需要較高刺激電壓的原因。野生型的破壞者螯蝦也需要較強的電流刺激才能排出精莢，電壓最高可調(diào)至55 V、頻率40～50 Hz、刺激時間在10 s以內(nèi)，體重為10.3～155 g[8]。相比野生型的破壞者螯蝦，本次試驗對人工天空藍魔進行具體規(guī)范：電壓45 V、頻率32Hz、刺激時間4s，規(guī)格體長(6.1±0.8)cm、體重(13.3±1.2)cm，不僅減少了對天空藍魔螯蝦的傷害，且精莢的排出率與野生型的效果相差不多，符合本次試驗目的。

值得注意的是，本文采用天空藍魔親蝦規(guī)格較小，大多為初次性成熟的個體。隨著年齡和體型的增加，其有效獲得精莢的電壓數(shù)值往往也會增加，因此在電壓設定需要考慮雄蝦規(guī)格的大小[3]。

3.2 天空藍魔精莢的形態(tài)及數(shù)目

甲殼動物十足目精莢由精子團、精莢基質(zhì)及精莢壁組成。天空藍魔的精莢壁與部分十足目動物不同，如天空藍魔的精莢壁與紅螯螯蝦比較接近，皆為管狀，橫切面為圓形封閉，所不同的是，天空藍魔精莢壁是呈C字形[9-10]。刀額新對蝦的精莢壁也是呈C字形不完全包裹的[11]，而在天空藍魔中為完全包裹。凡納濱對蝦精莢內(nèi)精子數(shù)量在(12.5±3.9)×106之間[12]，鋸緣青蟹精莢內(nèi)精子數(shù)在(2～10)×106之間[13]，天空藍魔精莢內(nèi)精子數(shù)量在5.2×104～1.13×106個之間，精莢內(nèi)精子細胞數(shù)量相差不大。本次試驗天空藍魔可獲取的精莢的最小規(guī)格為體長5.2 cm、重量11.6 g。有研究表明精子數(shù)量與體長、體質(zhì)量和精子合格率無顯著性相關[14]，與本次試驗結果相符。

3.3 精莢再生周期

本次試驗最短可間隔7 d對同一尾天空藍魔再次獲得精莢，研究表明，斑節(jié)對蝦精莢再生時間為15 d，當間隔時間少于6 d時，會導致精莢質(zhì)量下降[14]。天空藍魔具體的精莢再生周期有待研究。精莢在排出后的一段時間內(nèi)具有一定的黏性，把它放到雌性天空藍魔開放式的納精囊上。在試驗過程中曾多次嘗試，但均未發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)卵受精的雌性個體。用電刺激獲取精莢為人工授精提供了精莢的來源，但是離成功人工授精還有很多工作要做。