一株大黃魚致病性溶藻弧菌的分離鑒定與毒力相關(guān)基因分析

陳洪清

(寧德市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 寧德 352103)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的海水經(jīng)濟魚類[1]，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的提高，大黃魚病害問題越發(fā)突出[2]，其已經(jīng)成為制約大黃魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，其中弧菌病是大黃魚養(yǎng)殖中較為流行的一種危害嚴(yán)重的細菌性疾病[3-4]?；【〉奈：ο蟀舜簏S魚、石斑魚(Epinephelussp.)、真鯛(Pagrosomusmajor)等福建省主要海水養(yǎng)殖魚類，體表潰瘍、出血，鰓絲腐爛是弧菌病的主要癥狀[5-7]。2018年6月，寧德蕉城大灣漁排部分體重約為100 g大黃魚表現(xiàn)出體表和鰭條潰瘍、出血，鰓缺損等癥狀，并出現(xiàn)零星死亡。鏡檢體表和鰓絲未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲，從患病魚鰓分離得到一株優(yōu)勢菌株，本研究對該菌株進行了生理生化鑒定、16S rDNA測定和毒力因子檢測，為該病的病原確定和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生化試劑

TCBS和TSA培養(yǎng)平板、TSB培養(yǎng)基以及生化鑒定管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)購自TaKaRa公司。

1.1.2 引物

本研究所用的引物如表1所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴增所用的引物和序列Tab.1 Primers and sequences for PCR amplification

1.1.3 實驗魚

回歸感染所用的健康大黃魚體重為(20±2)g，暫養(yǎng)于寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司體積為2 000 L的玻璃纖維桶中，暫養(yǎng)條件為水溫25℃，水體500 L，溶氧5 mg/L，日常投喂天馬公司的大黃魚配合飼料，每日投喂1次，日投餌率為1%。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

患病大黃魚來自寧德蕉城大灣漁排，表現(xiàn)出明顯體表和鰭條潰瘍、充血(圖1)，鰓缺損、充血等癥狀。將大黃魚置于氧化袋中，活體運至實驗室進行細菌分離，在超凈工作臺下，用酒精棉球(含70%酒精)擦拭體表，用無菌解剖剪剪下鰓蓋，將無菌接種環(huán)探入鰓絲缺損處，劃線于TCBS培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)24 h后從形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落中挑取一個單菌落接種于TSA平板繼續(xù)純化，28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，挑取一個單菌落用TSB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)。

1.2.2 分離菌株的生理生化鑒定

用接種環(huán)在無菌條件下挑取TSA平板上的單菌落接種于生化鑒定管，按使用說明書培養(yǎng)，觀察其生理生化特征。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》(第九版)[11]，并對比標(biāo)準(zhǔn)株的生理生化特性，對其進行鑒定。

1.2.3 分離菌株的16S rDNA鑒定

從TSA平板挑取單菌落，接種于10 mL TSB培養(yǎng)液，于28℃以120 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h，200×g離心10 min，收集菌體，按照OMEGA細菌DNA提取試劑盒方法提取菌體DNA作為PCR模板，PCR體系為Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 25 μL，模板1 μL 引物27F(10 μM)2 μL，引物1492R(10 μM)2 μL，無菌水20 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 預(yù)變性2 min；94℃ 35 s，55℃復(fù)性 45 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將所得序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，通過Clustal X 2.0和Mega 4.0分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 分離菌株致病性

將大黃魚分為6組，每組20尾，在水溫25℃時，分別用不同數(shù)量的菌腹腔注射回歸感染，菌液的稀釋液為生理鹽水，每尾注射200 μL，各組感染的菌數(shù)如表2所示。連續(xù)觀察10 d后，根據(jù)寇氏法公式lg LC50=XK- C∑[Pi+P(i+1)]計算該菌對大黃魚的半數(shù)致死劑量。其中：XK為最大劑量的對數(shù)；C為相鄰劑量比值的對數(shù)；Pi、P(i+1)為各劑量組的死亡率。

表2 回歸感染各組的菌數(shù)Tab.2 Number of bacteria in each group of regression infection

1.2.5 分離菌株毒力相關(guān)因子檢測

分離菌株毒力相關(guān)基因進行檢測，PCR體系為：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 25 μL，菌DNA模板1 μL 上游引物(10 μM)2 μL，下游引物(10 μM)2 μL，無菌水20 μL。PCR反應(yīng)條件95℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s，34個循環(huán)；72℃ 7 min。反應(yīng)完成后對PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

分離得到的菌接種TCBS平板后，得到均一的，表面光滑、有黏性、直徑1～2 mm的圓形黃色菌落(圖2)。

2.2 分離菌株生理生化鑒定

菌株的生理生化特征如表3所示，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)和標(biāo)準(zhǔn)株17700的生化特性，證實所分離得到的菌為溶藻弧菌，將所得到的菌命名為Val180620。

表3 菌株Val180620的生理生化鑒定結(jié)果Tab.3 Physiological and biochemical identification results of strain Val180620

續(xù)表3

注：“+”為反應(yīng)陽性，“-”為反應(yīng)陰性，“R”為抗性，“S”為敏感, “OF”為氧化發(fā)酵型。
Notes: “+”positive, “-” negative, “R”resistance，“S” sensitive，“OF” oxidative fermentation.

2.3 分離菌株16S rDNA鑒定

經(jīng)測序，可知菌株Val180620擴增得到的16S rDNA基因長度1 517 bp，將該基因序列提交Genebank，Genebank登錄號：SUB6036977，通過與Genebank上相關(guān)菌株16S rDNA基因的同源性比較，發(fā)現(xiàn)該菌與溶藻弧菌的同源率為99%(圖3)。

2.4 細菌的致病力

Val180620人工感染結(jié)果如表4所示。根據(jù)寇式公式，計算得到該菌的半數(shù)致死量LD50為2.38×106CFU。

表4 菌株Val180620感染后大黃魚死亡情況表Tab.4 Death of the Large yellow croaker after infection with strain Val180620 %

2.5 細菌毒力相關(guān)因子攜帶情況

毒力相關(guān)基因PCR結(jié)果如圖4所示，Val180620攜帶有毒力因子CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH。

注：M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；1為Collagenase基因；2為ToxR基因；3為UreR基因；4為FlaA基因；5為TRH基因；6～10為空白對照。
Notes：M.DNA marker(DL2000)；Lane 1.Collagenase gene；Lane 2.ToxR gene；Lane 3.UreR gene；Lane 4.FlaA gene；Lane 5.TRH gene；Lane 6～10.Control.

3 討論

溶藻弧菌廣泛分布于世界各海域，且數(shù)量居海洋弧菌之首[13]。本研究從患病大黃魚分離到的優(yōu)勢菌，表現(xiàn)出溶藻弧菌的典型生理生化特征，其16S rDNA與溶藻弧菌的同源率達到99%，證實其為溶藻弧菌，但從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，該菌16S rDNA與GENE BANK中的溶藻弧菌KC884661.1和KC884629.1仍有一定的遺傳距離。

溶藻弧菌具有致病性，本研究的回歸感染實驗證實，Val180620對(20±2)g大黃魚的半致死量為LD50為2.38×106CFU，錢榮華等用臨床分離得到的溶藻弧菌對(50±10)g的大黃魚進行腹腔注射感染，其半致死量為2.0×107CFU[12]。二者半致死量存在差異，這種毒力差異除了與菌株的培養(yǎng)條件以及感染魚的大小有關(guān)系外，與菌株本身的差異也有關(guān)系。

為尋找與該菌致病力相關(guān)的基因，本研究對該菌膠原蛋白酶Collagenase、ToxR蛋白、鞭毛蛋白FlaA、脲激酶UreR和溶血素TRH等毒力基因進行了檢測，發(fā)現(xiàn)該菌存在CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH基因。本次發(fā)病魚表現(xiàn)出體表潰瘍、鰓缺損等癥狀，而膠原蛋白酶Collagenase在一定pH和溫度等條件下可特異水解膠原蛋白[14]，暗示著該酶有可能在引起發(fā)病魚潰瘍等癥狀過程中發(fā)揮著作用。ToxR基因、TRH基因均與溶血相關(guān)[15-19]，本次發(fā)病魚表現(xiàn)出明顯的出血癥狀，與這二個基因的存在應(yīng)有密切的關(guān)聯(lián)。FlaA是與運動相關(guān)的鞭毛蛋白的重要組成基因，與菌的侵染能力相關(guān)[20]，該基因的存在應(yīng)是菌株Val180620表現(xiàn)出較強致病力的原因之一。有報道稱UreR在病原感染的多個致病過程中發(fā)揮著作用[21]，與冼鈺茵的研究結(jié)果一致[22]，本研究也未從菌株Val180620中檢測出UreR基因，但菌株Val180620仍表現(xiàn)出較強的致病性，說明UreR不是決定溶藻弧菌毒力的主要因子。

目前，在大黃魚養(yǎng)殖過程中，弧菌病的防控仍以化學(xué)藥物治療為主，抗生素等藥物的過度使用易導(dǎo)致病原產(chǎn)生耐藥和水產(chǎn)品藥殘等問題。免疫防控是水產(chǎn)病害防控的必然趨勢。本研究結(jié)果表明溶藻弧菌Val180620中存在CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH等毒力相關(guān)基因，對這些基因進行深入研究，有望為溶藻弧菌的亞單位疫苗的研發(fā)提供幫助。