對蝦白斑綜合征病毒可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)快速檢測方法的建立

吳麗云

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，屬十足目(Decapoda)、對蝦科(Penaeidae)，又稱南美白對蝦[1]，原產(chǎn)地南美洲，喜好泥沙底質(zhì)，為廣溫廣鹽性熱帶性種類，具有生長迅速、抗逆能力較強、適合高密度養(yǎng)殖等特點[2]。自1988年引入中國以來，凡納濱對蝦的養(yǎng)殖在國內(nèi)逐漸推廣，市場對凡納濱對蝦產(chǎn)品的需求量日益增加，對蝦養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，其產(chǎn)量也隨技術(shù)的日趨成熟而不斷提高。據(jù)2019年的中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示，2018年我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達176×104t，占對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的85.8%，成為我國對蝦養(yǎng)殖最主要的品種[3]。

近年來，在對蝦養(yǎng)殖業(yè)集約化、高密度養(yǎng)殖過程中，一些負面影響也在逐漸顯現(xiàn)，如養(yǎng)殖環(huán)境惡化、種質(zhì)退化、病害頻發(fā)等問題日益嚴(yán)重，影響了我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展[4]。其中，對蝦病害的大范圍、廣泛性的暴發(fā)對產(chǎn)業(yè)的危害尤為嚴(yán)重，導(dǎo)致經(jīng)濟效益大幅下滑，給行業(yè)帶來難以估量的損失。目前對對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害較大的病原有白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、蝦血細胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)及急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS)等，而對蝦病毒病是養(yǎng)殖過程中的主要病害，對產(chǎn)業(yè)造成了巨大的威脅，已成為制約對蝦養(yǎng)殖的主要問題之一[5-9]。

白斑綜合征病毒屬于線頭病毒科(Nimaviridae)，是危害較為嚴(yán)重的水生動物病毒之一[10]。該病毒粒子包被雙層囊膜，基因組為環(huán)狀、雙鏈DNA，大小約為300 kb，預(yù)測編碼約180種蛋白[11]。它的宿主范圍廣泛，包括所有養(yǎng)殖和野生的海洋蝦蟹、蝦蛄、橈足類和淡水蝦[12]，該病毒傳播迅速，致病性強，感染該病毒后在3～10 d內(nèi)死亡率最高可達到100%[13]，對我國及世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。1995年世界動物衛(wèi)生組(Office International Des Epizooties，OIE)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)和亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心(Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific，NACA)同時將WSSV列為需要監(jiān)測的重要水生動物疫病。2009年被我國農(nóng)業(yè)部公告第1125號《一、二、三類動物疫病病種名錄》列為水生生物一類動物疫病病毒。因此開發(fā)新的操作簡單、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏性好的檢測WSSV技術(shù)，加強對SPF親蝦及產(chǎn)生的幼蝦、成蝦攜帶感染情況的實時監(jiān)測，對預(yù)防和降低該病的暴發(fā)，保障我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種靈敏的鏈置換反應(yīng)，它可以在恒溫下不到1 h內(nèi)將幾個拷貝擴增至109拷貝的一種新型等溫擴增技術(shù)。Notomi等[14]在2000年報道，可在恒溫條件下(60～65℃左右)對目標(biāo)基因進行高效擴增，因此可在水浴鍋或者普通的金屬浴內(nèi)完成擴增反應(yīng)；與其他技術(shù)相比，該技術(shù)具有明顯優(yōu)勢，如診斷特異性強、分析靈敏度高、儀器設(shè)備要求低、操作方法簡單等。許多針對特定病原的診斷方法己經(jīng)開發(fā)為體外診斷試劑盒并進入常規(guī)檢測應(yīng)用[15-17]。

本文基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)建立了對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)現(xiàn)場快速高靈敏度檢測試劑盒。根據(jù)WSSV基因組保守區(qū)序列，設(shè)計合成5條LAMP特異性引物，利用鈣黃綠素為檢測指示劑，建立了直觀、可視化的WSSV-LAMP快速檢測方法。通過臨床檢測驗證適用性，以期在對蝦基層養(yǎng)殖場實現(xiàn)對蝦WSSV診斷特異、簡便、快速以及高效的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

凡納濱對蝦采自于廈門市海滄廈興龍水產(chǎn)種苗有限公司。NNV(神經(jīng)壞死病毒核酸)、IHHNV(傳染性皮下及造血組織壞死病毒核酸)、MCP(細胞腫大虹彩病毒核酸)、檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蝦核酸(凡納濱對蝦總核酸)和魚核酸(斜帶石斑魚總核酸)等核酸均由本實驗室保存。BstDNA聚合酶購自紐英倫(NEB)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；序列合成和DNA測序委托上海捷瑞生物工程有限公司完成；其余試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 對蝦DNA提取及PCR檢測

取健康凡納濱對蝦鰓部組織約20 mg，參照天根基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。并以此為模板參照GB/T 28630.2—2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程中套式PCR檢測法，同時以雙蒸水作為陰性對照進行PCR擴增[18]。

1.3 白斑綜合征病毒陽性質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的白斑綜合征病毒基因，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成該病毒的部分核酸序列。將該合成的核酸序列與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞。細胞涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上。從平板挑選30個單菌落進行菌落PCR鑒定重組子(pMD18-WSSV)，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由上海捷瑞生物工程有限公司測序，鑒定重組質(zhì)粒pMD18-WSSV中的插入序列，以用作后續(xù)LAMP體系建立的陽性核酸標(biāo)準(zhǔn)模板。

1.4 白斑綜合征病毒LAMP引物及序列

根據(jù)白斑綜合征病毒基因保守序列，采用PrimerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/e/)設(shè)計LAMP引物，選取內(nèi)引物FIP/BIP的Tm值在65℃左右，外引物F3/B3的溫度為60℃左右，F(xiàn)IP/BIP的5′端dataG值小于等于-4 kcal/mol，F(xiàn)3/B3的3′端dataG值小于等于-4 kcal/mol，GC含量在40%～60%之間，引物擴增片段在200 bp左右的引物作為初篩引物，并分別記為WSSV-1、WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4，每套引物分別包含2條內(nèi)引物(FIP和BIP)、2條外引物(F3和B3)和1條環(huán)引物(LF或LB)(表1)。所有引物交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 LAMP引物及序列Tab.1 The primer sequences of LAMP

1.5 白斑綜合征病毒LAMP引物初步篩選

采用總體積為25 μL的反應(yīng)體系，其中包括：FIP、BIP各40 pmol，F(xiàn)3、B3各5 pmol，LF或LB 20 pmol，BstDNA聚合酶(8U)1.0 μL，鈣黃綠素(FD)1.0 μL，dNTPs(10 mM) 2.5 μL，2×反應(yīng)緩沖液(20 mM Tris-HCl pH 8.8，10 mM(NH4)2SO4，10 mM KCl，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100和0.8 M甜菜堿)12.5 μL，模板2 μL，雙蒸水補齊。將第1套(WSSV-1)、第2套(WSSV-2)、第3套(WSSV-3)和第4套(WSSV-4)引物組分別以1.3中制備的重組質(zhì)粒pMD18-WSSV為陽性核酸樣本和雙蒸水為模板，在63℃下進行LAMP反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴增曲線分析擴增結(jié)果。

1.6 白斑綜合征病毒LAMP引物的假陽性驗證

采用1.5中建立的25 μL反應(yīng)體系，將WSSV-1、WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4引物組分別以1.2中制備的陰性核酸樣本和雙蒸水為模板，在63℃下進行LAMP反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴增曲線分析擴增結(jié)果。

1.7 白斑綜合征病毒引物特異性實驗

采用1.5中建立的25 μL反應(yīng)體系，分別對WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4引物組進行特異性試驗。通過在添加和不添加FD的條件下(添加FD的為在反應(yīng)體系中加入1.0 μL的鈣黃綠素)，分別以陽性核酸、水、NNV(神經(jīng)壞死病毒核酸)、IHHNV(傳染性皮下及造血組織壞死病毒核酸)、MCP(細胞腫大虹彩病毒核酸)、檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蝦(凡納濱對蝦總核酸)和魚(斜帶石斑魚總核酸)為模板，在63℃下進行LAMP反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴增曲線和紫外下觀察擴增產(chǎn)物的顏色變化，分析檢測結(jié)果，驗證3套引物組在LAMP檢測方法中的特異性。

1.8 白斑綜合征病毒引物靈敏度檢測

將1.3中制備的pMD18-WSSV陽性質(zhì)粒(5 μg)加入500 μL雙蒸水，終濃度為10 ng/μL；并以雙蒸水將其進行10倍遞進稀釋，使其濃度依次為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL、1 ag/μL、0.1 ag/μL等。

采用1.5中建立的25 μL反應(yīng)體系，分別對WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4引物組進行靈敏度檢測。分別以1 ng/μL(2.25×108copies/μL)、100 pg/μL(2.25×107copies/μL)、10 pg/μL(2.25×106copies/μL)、1 pg/μL(2.25×105copies/μL)、100 fg/μL(2.25×104copies/μL)、10 fg/μL(2.25×103copies/μL)、1 fg/μL(225 copies/μL)、100 ag/μL(22.5 copies/μL)、10 ag/μL(2.25 copies/μL)以及1 ag/μL(0.225 copies/μL)濃度的pMD18-WSSV陽性質(zhì)粒為模板，在LAMP實時濁度儀上63℃反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴增曲線和紫外下觀察擴增產(chǎn)物的顏色變化，分析檢測結(jié)果，驗證3套引物組在LAMP檢測方法中的特異性。

2 結(jié)果

2.1 白斑綜合征病毒LAMP引物初步篩選

根據(jù)設(shè)計的4套引物組對WSSV保守序列進行LAMP擴增結(jié)果(圖1)顯示，LAMP引物組WSSV-1在60 min內(nèi)未能擴增出陽性核酸，故舍棄。引物組WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4在30 min左右能夠有效擴增陽性核酸，且以雙蒸水作為檢測模板的陰性對照在60 min內(nèi)未出現(xiàn)非特異擴增，所以該3套引物初步能夠使用，待后續(xù)繼續(xù)驗證。

2.2 白斑綜合征病毒LAMP引物的假陽性驗證

LAMP引物驗證結(jié)果(圖2)顯示，在以陰性核酸為模板時，3套LAMP引物檢測結(jié)果均未出現(xiàn)非特異性擴增。結(jié)合2.1初步篩選的結(jié)果，將WSSV-1引物舍棄，進一步驗證WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4三套引物的特異性和靈敏度。

2.3 白斑綜合征病毒引物特異性實驗

采用建立的LAMP反應(yīng)體系檢測3套引物的特異性，結(jié)合濁度儀獲得的擴增曲線(圖3，未加FD)與紫外光下擴增產(chǎn)物的顏色變化結(jié)果(圖4，加FD)可知：WSSV-2引物對陽性核酸樣本檢測呈陽性，而對雙蒸水、NNV、IHHNV、MCP、檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蝦和魚等樣本的檢測均呈陰性，無交叉反應(yīng)，與預(yù)期結(jié)果一致，具有高的特異性。

注：1.陽性核酸；2.水；3.NNV；4.IHHNV；5.MCP；6.檸檬酸桿菌；7.綠膿桿菌；8.沙門氏菌；9.金黃色葡萄球菌；10.蝦；11.魚。圖6、8同此。
Notes.1.Positive control；2.Water；3.NNV；4.IHHNV；5.MCP ；6.CitrobacterWerkman and Gillen；7.Pseudomonas；8.Salmonella；9.Staphylococcusaureus；10.Shrimp；11.Fish.Figure 6 and Figure 8 were the same as Figure 4.

結(jié)合獲得的擴增曲線(圖5，未加FD)與紫外光下擴增產(chǎn)物的顏色變化結(jié)果(圖6，加FD)可知：WSSV-3引物對陽性核酸樣本檢測呈陽性，而對雙蒸水、NNV、IHHNV、MCP、檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蝦和魚等樣本的檢測均呈陰性，無交叉反應(yīng)，與預(yù)期結(jié)果一致，具有高的特異性。

結(jié)合獲得的擴增曲線(圖7，未加FD)與紫外光下擴增產(chǎn)物的顏色變化結(jié)果(圖8，加FD)可知：WSSV-4引物對陽性核酸樣本檢測呈陽性，而對雙蒸水、NNV、IHHNV、MCP、檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蝦和魚等樣本的檢測均呈陰性，無交叉反應(yīng)，與預(yù)期結(jié)果一致，具有高的特異性。

2.4 白斑綜合征病毒引物靈敏度檢測

以10倍系列稀釋的pMD18-WSSV陽性質(zhì)粒模板進行LAMP檢測引物靈敏度結(jié)果(圖9和圖10)顯示：陽性質(zhì)粒含量在2.25×108～2.25 copies/μL均能檢測到擴增，而雙蒸水對照未見擴增，可見WSSV-2引物組的最低檢測限約為2.25～0.225 copies/μL。

注：1.2.25×108copies/μL；2.2.25×107copies/μL；3.2.25×106copies/μL；4.2.25×105copies/μL；5.2.25×104copies/μL；6.2.25×103copies/μL；7.225 copies/μL；8.22.5 copies/μL；9.2.25 copies/μL；10.0.225 copies/μL；11.水。下圖同此。
Notes：1.2.25×108copies/μL；2.2.25×107copies/μL；3.2.25×106copies/μL；4.2.25×105copies/μL；5.2.25×104copies/μL；6.2.25×103copies/μL；7.225 copies/μL；8.22.5 copies/μL；9.2.25 copies/μL；10.0.225 copies/μL；11.Water.The same as below.

以10倍系列稀釋的pMD18-WSSV陽性質(zhì)粒模板進行LAMP檢測引物靈敏度結(jié)果(圖11和圖12)顯示：陽性質(zhì)粒含量在2.25×108～2.25 copies/μL均能檢測到擴增，而雙蒸水對照未見擴增，可見WSSV-3引物組的最低檢測限約為2.25～0.225 copies/μL。

注：11.0.022 5 copies/μL;12.水。
Notes：11.0.022 5 copies/μL;12.Water.

WSSV-4靈敏度試驗結(jié)果如圖13和14所示，病毒陽性質(zhì)粒含量在2.25×108～225 copies/μL均能檢測到擴增，而雙蒸水對照未見擴增，可見WSSV-4引物組的最低檢測限約為225～22.5 copies/μL。

3 討論

隨著中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，產(chǎn)業(yè)面臨著諸多問題和挑戰(zhàn)，例如病原微生物大量繁殖、高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致對蝦抗病力下降、野生資源匱乏等嚴(yán)重影響了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。20世紀(jì)90年代初，對蝦白斑綜合征(White Spot Disease，WSD)暴發(fā)于我國臺灣地區(qū)，此后迅速傳播至整個亞洲及歐美的主要對蝦養(yǎng)殖地區(qū)，對對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。對蝦養(yǎng)殖業(yè)中，WSSV在個體間或群體間的主要傳播方式是水平傳播，研究表明口和消化道是宿主感染W(wǎng)SSV的主要途徑[19]。如對蝦病發(fā)病養(yǎng)殖場排出的廢水、育苗時期購入的攜帶WSSV病毒的蝦苗、運輸過程中盛放感染W(wǎng)SSV病害水產(chǎn)品的設(shè)備等，都會造成WSSV大范圍的水平傳播。目前市面上仍沒有針對WSSV病毒非常有效的阻斷或防治手段，盡早檢出和清除病原攜帶者、培育或選擇無病原種苗、切斷傳播途徑等是最有效的預(yù)防措施，因此早期快速的診斷和篩查在疫病防控中起到了決定性作用[20]，而建立快速簡便的體外診斷技術(shù)則為疫病監(jiān)測提供了必要的保障。

目前，已建立了許多診斷WSSV的方法，包括：目視檢查法、傳統(tǒng)組織學(xué)檢測方法、電子顯微技術(shù)、生化檢驗法、細胞培養(yǎng)方法、免疫學(xué)的 ELISA 技術(shù)、分子生物學(xué)的核酸探針和PCR技術(shù)等。近年來，巢式PCR作為一種有效的檢測方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于WSSV的檢驗中，然而PCR對試驗的要求高，復(fù)雜的變溫過程消耗了較長時間(4～8 h)，同時需要較高的檢測費用、昂貴的PCR儀器以及對檢測人員較高的技術(shù)要求，導(dǎo)致無法對疫情做到早期、快速的預(yù)測，從而大大限制了其在對蝦養(yǎng)殖場的實際應(yīng)用。2000年Notomi等[14]研發(fā)的LAMP技術(shù)，針對靶基因設(shè)計特殊引物和應(yīng)用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，高效擴增靶基因。LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區(qū)域，反應(yīng)特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能滿足反應(yīng)要求，檢測成本大大降低；反應(yīng)形成一系列不同長度莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 DNA 產(chǎn)物，可以通過電泳、SYBR Green I染色、觀察沉淀等方法檢測。LAMP快速檢測方法是目前最簡便、快捷的病毒檢測技術(shù)，快捷且成本低，結(jié)果判定形象直觀，特別適用于現(xiàn)場快速診斷病毒性疾病。

本研究建立了一種對蝦白斑綜合征病毒的LAMP檢測方法，利用3套引物(內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物)識別、擴增靶核苷酸序列，極大提高了反應(yīng)的特異性。根據(jù)WSSV引物的初步篩選和驗證的LAMP實驗結(jié)果顯示，LAMP引物組WSSV-1在60 min內(nèi)未能擴增出陽性核酸，故舍棄。其余3套引物(WSSV-2、WSSV-3、WSSV-4)能在30 min左右將陽性核酸擴增出來，且以雙蒸水為對照60 min內(nèi)未出現(xiàn)非特異擴增，同時，LAMP引物的假陽性實驗結(jié)果顯示，WSSV-2、WSSV-3、WSSV-4對陰性核酸樣品沒有出現(xiàn)非特異性擴增，說明該3套引物能夠使用。特異性實驗結(jié)果顯示，未加FD和加入FD的WSSV-2、WSSV-3、WSSV-4引物組對陽性核酸樣本都能夠有效檢測出，而對NNV、IHHNV、MCP、檸檬酸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蝦、魚和雙蒸水等都未檢測出，特異性高。靈敏度實驗結(jié)果顯示，WSSV-2引物組的最低檢測限約為2.25～0.225 copies/μL；WSSV-3引物組的最低檢測限約為2.25～0.225 copies/μL；WSSV-4引物組的最低檢測限約為225～22.5 copies/μL。其中WSSV-2和WSSV-3引物組的最低檢測限均低于何琳等[21]建立的LAMP方法最低檢測限100 copies/μL；馮華等[22]建立的LAMP方法最低檢測限10 copies /μL；馬芳等[23]建立的LAMP方法最低檢測限100 copies /μL。綜上結(jié)果表明，本研究建立的LAMP檢測方法具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，能夠滿足實際應(yīng)用中的WSSV高靈敏度檢測需求?？梢詸z出對蝦白斑綜合征發(fā)病早期或隱性感染階段養(yǎng)殖對蝦體內(nèi)攜帶的較低數(shù)量的病毒，可在現(xiàn)場對養(yǎng)殖對蝦進行及時檢測，于白斑綜合征發(fā)病早期檢測出 WSSV 的存在，為養(yǎng)殖者和管理者采取必要的措施提供參考，降低白斑綜合征暴發(fā)的概率。