光周期對四指馬鲅視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視蛋白表達的影響及其生物信息學分析

周 慧，區(qū)又君*，溫久福，李加兒，藍軍南，2

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學，水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

視覺是生物重要的感覺之一。由于生存環(huán)境復雜多樣，硬骨魚類的視覺器官在形態(tài)學以及細胞學方面呈現(xiàn)出高度的多樣性，是研究魚類生態(tài)習性及魚類對環(huán)境適應性的良好素材。四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)隸屬于鯔形目(Mugiliformes)馬鲅亞目(Polynemoidei)馬鲅科(Polynemidae)四指馬鲅屬[1]，是一種暖溫性的海水魚類，亦能在咸淡水和淡水中生存，喜棲息于近海、江河入?？?、泥沙質(zhì)海底等地帶[2-3]。其體長而側(cè)扁，胸鰭下方具有4條長短不一的絲狀鰭條，能用于探測食物[4-5]。四指馬鲅具有生長迅速、肉質(zhì)細嫩鮮美等特點，且養(yǎng)殖空間和消費群體巨大，具有廣闊的經(jīng)濟前景。目前有關(guān)該魚的研究主要集中在基礎(chǔ)生物學、漁業(yè)資源調(diào)查、形態(tài)分類學、遺傳學以及人工繁育等方面[6-10]，該魚的視覺器官對環(huán)境的適應性研究尚未見報道。

脊椎動物視覺系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)和功能之間有著特定的關(guān)系。視覺器官是從中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的，有眼球及其輔助裝置兩大部分構(gòu)成，眼球由屈光系統(tǒng)、視網(wǎng)膜和眼球壁組成[11-12]。視網(wǎng)膜是一層透明的薄膜，是形成視覺的生理基礎(chǔ)[13]。視網(wǎng)膜上的感光細胞承擔著將光信號轉(zhuǎn)換為電信號重要作用。對魚類視覺特性的研究發(fā)現(xiàn)，感光細胞的細胞種類和排列方式的不同反映了不同的視覺特性。由單錐細胞和雙錐細胞形成的鑲嵌結(jié)構(gòu)能提高視網(wǎng)膜對運動物體的敏感性，有利于魚類在弱光條件下分辨運動的物體[14-15]。視覺系統(tǒng)作為感覺系統(tǒng)重要組成部分，與生物體的進化是密不可分的。如進化地位較為低等的兩棲類和爬行類生物的感光細胞，雖然在數(shù)量上不占優(yōu)勢，但其外節(jié)直徑卻較長，以此來增加感光細胞外節(jié)膜盤的面積和對光能的吸收，進而提高視敏度[16-17]。

視蛋白(Opsin)是一種跨膜蛋白[18]，約含有350個左右的氨基酸殘基，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[19]。根據(jù)其對視覺成像是否有直接作用而分視覺系統(tǒng)視蛋白和非視覺系統(tǒng)視蛋白兩大類[20]。視覺系統(tǒng)視蛋白主要存在于視桿細胞和視錐細胞中，在視覺圖像形成方面起著至關(guān)重要的作用。視桿細胞中的視蛋白為視紫紅質(zhì)(Rhodopsin，RH1)。視錐細胞中的視蛋白根據(jù)吸收光譜范圍的不同又可分為以下4種：長波長敏感視蛋白(Long wave sensitive opsin，LWS)，又可稱之為紅色敏感視蛋白(Red opsin)；中波長敏感視蛋白(Rhodopsin-like，RH2)，又可稱之為綠色敏感視蛋白(Green opsin)；短波長敏感視蛋白(Short wave sensitive opsin 2，SWS2)，又可稱之為藍色敏感視蛋白(Blue opsin)；超短波長敏感視蛋白(Short wave sensitive opsin 1，SWS1)，又可稱之為紫外敏感視蛋白(Ultraviolet opsin)[21-22]。

本文以四指馬鲅為研究對象，研究了在不同光照周期下飼養(yǎng)的四指馬鲅視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)、細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，運用生物信息學和分子生物學的方法研究了四指馬鲅RH1、LWS、RH2、SWS2視蛋白的核酸序列和氨基酸序列及其在不同光照周期條件下表達量的變化，以期了解視覺器官的結(jié)構(gòu)和功能，以及視蛋白對不同光照周期的適應性變化，為深入了解視覺器官對不同光照周期的適應性機制奠定基礎(chǔ)，同時有利于闡明其行為機制，為其資源保護及模式的選擇提供理論依據(jù)，亦為魚類視覺特性和動物視覺器官的進化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

四指馬鲅仔魚由本課題組在南海水產(chǎn)研究所珠海試驗基地培育所得。光照周期分別設(shè)置為晝夜比0 h∶24 h和24 h∶0 h共2個光照周期組，12 h∶12 h為對照組。每組3個平行組，每個平行組30尾。實驗在光照強度為(500±100) lux、水溫25℃、鹽度5的條件下養(yǎng)殖60 d。在養(yǎng)殖的第30天和第60天時摘取眼球組織(每組取6尾)并迅速放入液氮中冷凍，24 h后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序及熒光定量PCR。每組另取9尾，分別用于光學顯微結(jié)構(gòu)觀察和透射電子超微結(jié)構(gòu)觀察。用于光學顯微結(jié)構(gòu)觀察的眼球組織置于10%的中性福爾馬林中固定。固定24 h后轉(zhuǎn)入70%的乙醇中保存。用于透射電子超微結(jié)構(gòu)觀察的眼球組織先用2.5%戊二醛(pH 7.4)于4℃固定24 h，而后在解剖鏡下剝離視網(wǎng)膜，再置于2.5%戊二醛(pH 7.4)4℃固定24 h。

1.2 四指馬鲅視網(wǎng)膜組織學切片和超微切片

制作組織學切片的樣品的脫水、透明、浸蠟和包埋等過程參考馬定昌等[23]的方法，先將樣品經(jīng)24 h流水沖洗，然后置于70%～100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。而后進行厚度為5 μm的連續(xù)石蠟切片，H.E染色后用中性樹脂封片。在德國Axio Scope A1型光學顯微鏡下對染色切片進行觀察分析并拍照。制作超微切片的樣品的脫水、包埋、切片及染色的過程參考林先智的方法[24]。

1.3 視蛋白核酸序列分析

在四指馬鲅眼球組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(百邁克生物科技有限公司)中篩選得到RH1、RH2、SWS2、LWS的核酸序列，運用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測和翻譯視蛋白序列的開放閱讀框，使用ExPASy的Protparam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)預測視蛋白氨基酸序列的相對分子質(zhì)量、等電點和穩(wěn)定性指數(shù)，利用ExPASy的ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)對視蛋白氨基酸序列的疏水性進行預測，通過歐洲生物信息研究所(EMBL-EBI)的InterProScan 5(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/)預測視蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)域，使用SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 預測視蛋白氨基酸的二級結(jié)構(gòu)。

1.4 熒光定量PCR

使用RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)并參照說明書提取于-80℃超低溫冰箱保存的四指馬鲅眼球總RNA。其后用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性，再通過NanoDrop 2000測量RNA的純度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒的方法合成cDNA。使用SYMR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒的方法來進行四指馬鲅RH1、RH2、SWS2和LWS的熒光定量PCR，每個樣品設(shè)3個重復。選用從四指馬鲅眼球組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選的β-actin核酸序列作為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計四指馬鲅RH1、RH2、SWS2和LWS和內(nèi)參基因的表達引物。引物序列見表1。

表1 RH1、RH2、SWS2、LWS和β-actin的引物序列Tab.1 Primer sequence of RH1、RH2、SWS2、LWS and β-actin

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法來分析四指馬鲅RH1、RH2、SWS2和LWS基因在不同光照周期下相對于內(nèi)參基因水平的表達變化。運用R語言對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One way ANOVA)，結(jié)果以平均值±標準差(X±SD)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 四指馬鲅視網(wǎng)膜在不同光照周期下組織學結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1為四指馬鲅在不同光照周期條件下視網(wǎng)膜的顯微結(jié)構(gòu)圖。由圖1可以看出，在不同光照周期條件下飼養(yǎng)的四指馬鲅的視網(wǎng)膜十層結(jié)構(gòu)完整，從外向內(nèi)依次為：色素上皮層(Retinal pigment epithelium，PEL)、感光層(即視錐視桿層)(Photoreceptor layer，RCL)、外界膜(External limiting membrane，OLM)、外核層(Outer nuclear layer，ONL)、外網(wǎng)層(Outer plexiform layer，OPL)、內(nèi)核層(Inner nuclear layer，INL)、內(nèi)網(wǎng)層(Inner plexiform layer，IPL)、神經(jīng)節(jié)細胞層(Ganglion cell layer，GCL)、神經(jīng)纖維層(Nerve fiber layer，NFL)和內(nèi)界膜(Inner limiting membrane，ILM)。不同光照周期下，視網(wǎng)膜并無明顯結(jié)構(gòu)異常。

注：1.0 h∶24 h條件下第30天視網(wǎng)膜(20×10)；2.12 h∶12 h條件下第30天視網(wǎng)膜(20×10)；3.24 h∶0 h條件下第30天視網(wǎng)膜(20×10)；4.0 h∶24 h條件下第60天視網(wǎng)膜(20×10)；5.12 h∶12 h條件下第60天視網(wǎng)膜(20×10)；6.24 h∶0 h條件下第60天視網(wǎng)膜(20×10)。PEL.色素上皮層；RCL.視錐視桿層；OLM.外界膜；ONL.外核層；OPL.外網(wǎng)層；INL.內(nèi)核層；IPL.內(nèi)網(wǎng)層；GCL.神經(jīng)節(jié)細胞層；NFL.神經(jīng)纖維層；ILM.內(nèi)界膜。
Notes：1.Retina structure in the light cycle of 0 hour light and 24 hours dark on thirtieth day(20 × 10)；2.Retina structure in the light cycle of 12 hour light and 12 hours dark on thirtieth day(20 × 10)；3.Retina structure in the light cycle of 24 hour light and 0 hours dark on thirtieth day(20 × 10)；4.Retina structure in the light cycle of 0 hour light and 24 hours dark on sixtieth day(20 × 10)；5.Retina structure in the light cycle of 12 hour light and 12 hours dark on sixtieth day(20 × 10)；6.Retina structure in the light cycle of 24 hour light and 0 hours dark on sixtieth day(20 × 10).

圖2為四指馬鲅在不同光照周期條件下視網(wǎng)膜視桿細胞和視錐細胞的外節(jié)和內(nèi)節(jié)的透射電鏡圖。由圖2可以看出，在第30天時，0 h∶24 h和12 h∶12 h條件下，視錐細胞和視桿細胞的外節(jié)結(jié)構(gòu)排列整齊，膜盤結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)節(jié)排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。而在24 h∶0 h條件下，視錐細胞和視桿細胞外節(jié)膜盤彎曲，間隙增大，排列混亂，內(nèi)節(jié)腫脹，排列較為混亂。在第60天時，在12 h∶12 h光照條件下，視錐細胞和視桿細胞的外節(jié)和內(nèi)節(jié)結(jié)構(gòu)與第30天時并無明顯差異。在0 h∶24 h光照條件下，視錐細胞和視桿細胞外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)較為完整，但排列較為混亂，內(nèi)節(jié)排列未見明顯異常。在24 h∶0 h光照條件下，雖然視錐細胞和視桿細胞外節(jié)排列較為整齊，但膜盤可見斷裂，內(nèi)節(jié)線粒體脊斷裂消失呈空泡狀，細胞間出現(xiàn)大量的空泡樣結(jié)構(gòu)。

注：1.0 h∶24 h條件下第30天視錐細胞和視桿細胞外節(jié)；2.0 h∶24 h條件下第60天視錐細胞和視桿細胞外節(jié)；3.12 h∶12 h條件下第30天視錐細胞和視桿細胞外節(jié)；4.12 h∶12 h條件下第60天視錐細胞和視桿細胞外節(jié)；5.24 h∶0 h條件下第30天視錐細胞和視桿細胞外節(jié)；6.24 h∶0 h條件下第60天視錐細胞和視桿細胞外節(jié)；7.0 h∶24 h條件下第30天視錐細胞和視桿細胞內(nèi)節(jié)；8.0 h∶24 h條件下第60天視錐細胞和視桿細胞內(nèi)節(jié)；9.12 h∶12 h條件下第30天視錐細胞和視桿細胞內(nèi)節(jié)；10.12 h∶12 h條件下第60天視錐細胞和視桿細胞內(nèi)節(jié)；11.24 h∶0 h條件下第30天視錐細胞和視桿細胞內(nèi)節(jié)；12.24 h∶0 h條件下第60天視錐細胞和視桿細胞內(nèi)節(jié)。
Notes：1.Outer segment of cones and rods in the light cycle of 0 hour light and 24 hours dark on thirtieth day；2.Outer segment of cones and rods in the light cycle of 0 hour light and 24 hours dark on sixtieth day；3.Outer segment of cones and rods in the light cycle of 12 hours light and 12 hours dark on thirtieth day；4.Outer segment of cones and rods in the light cycle of 12 hours light and 12 hours dark on sixtieth day；5.Outer segment of cones and rods in the light cycle of 24 hours light and 0 hour dark on thirtieth day；6.Outer segment of cones and rods in the light cycle of 24 hours light and 0 hour dark on sixtieth day；7.Inner segment of cones and rods in the light cycle of 0 hour light and 24 hours dark on thirtieth day；8.Inner segment of cones and rods in the light cycle of 0 hour light and 24 hours dark on sixtieth day；9.Inner segment of cones and rods in the light cycle of 12 hours light and 12 hours dark on thirtieth day；10.Inner segment of cones and rods in the light cycle of 12 hours light and 12 hours dark on sixtieth day；11.Inner segment of cones and rods in the light cycle of 24 hours light and 0 hour dark on thirtieth day；12.Inner segment of cones and rods in the light cycle of 24 hours light and 0 hour dark on sixtieth day.

2.2 四指馬鲅RH1、RH2、SWS2和LWS基因的生物信息學分析

四指馬鲅RH1、RH2、SWS2和LWS的核酸序列均已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為KY949237、KY949238、KY949239、KY949236。RH1的cDNA開放閱讀框為1 059 bp，編碼352個氨基酸(圖3)；RH2的cDNA開放閱讀框為1 059 bp，編碼352個氨基酸(圖4)；SWS2的cDNA開放閱讀框為1 056 bp，編碼351個氨基酸(圖5)；LWS的cDNA開放閱讀框為1 074 bp，編碼357個氨基酸(圖6)。

注：上面為核酸序列，下面為氨基酸序列；小寫字母表示編碼序列；Rhodopsin_N結(jié)構(gòu)域用下劃線表示；7tm結(jié)構(gòu)域用灰色部分表示。以下同此。
Notes：The deduced amino acid sequence was shown below the nucleotide sequence；The lowercase letter indicated the open reading frame sequence；Rhodopsin_N domain was underlined；7tm domain was shown in grey.The same as below.

利用ProParam、SOPMA和歐洲生物信息研究所(EMBL-EBI)的InterProScan 5等在線分析程序?qū)λ闹格R鲅RH1、RH2、SWS2、LWS進行蛋白質(zhì)序列分析、預測蛋白二級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如表2。

表2 四指馬鲅RH1、RH2、SWS2、LWS的蛋白質(zhì)序列分析Tab.2 Protein sequence analysis of RH1、RH2、SWS2 and LWS of E.tetradactylum

2.3 四指馬鲅視蛋白在不同光照周期下的表達

由圖7可以看出，經(jīng)過不同的光照周期飼養(yǎng)30 d后，RH1、RH2、SWS2和LWS基因在0 h∶24 h和12 h∶12 h這兩組的表達差異均不顯著，而在24 h∶0 h光照條件下則顯著增高。說明在24 h光照周期中，當光照時長大于暗黑時長時，光照時間的增加能促進RH1、RH2、SWS2和LWS基因的表達。

由圖8所示，隨著飼養(yǎng)時間的延長，RH1、RH2、SWS2和LWS基因的表達量出現(xiàn)不同的變化。RH1基因在0 h∶24 h和12 h∶12 h這兩組的表達量有所增加，在第60天時，RH1在0 h∶24 h、12 h∶12 h、24 h∶0 h這三組的表達量差異不顯著。同樣，SWS2基因在12 h∶12 h組表達量顯著增加，使得其在60 d的表達量差異不顯著。LWS基因在0 h∶24 h組顯著降低，而在12 h∶12 h組顯著增加，在第60天時，LWS基因在12 h∶12 h和24 h∶0 h這兩組的表達量顯著高于0 h∶24 h組的表達量。而RH2基因在0 h∶24 h組顯著增加，而在12 h∶12 h和24 h∶0 h這兩組變化不顯著，使得其在第60天時在0 h∶24 h組的表達量是最高的。但RH1、SWS2和LWS基因在0 h∶24 h、12 h∶12 h、24 h∶0 h這三組表達量的總體趨勢是12 h∶12 h組最高。

注：不同的小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。以下同此。
Notes：Different lowercase letters indicated statistically significant differences(P<0.05).The same as below.

在0 h∶24 h條件下，RH1、RH2、SWS2和LWS基因在第30天的表達量分別為0.64、1.04、0.47、0.80，而在第60天的表達量分別為0.89、0.43、1.71、0.86。在12 h∶12 h條件下，RH1、RH2、SWS2和LWS基因在第30天的表達量分別為1.01、0.35、0.73、0.62，而在第60天的表達量分別為1.34、1.58、0.71、1.19。在24 h∶0 h條件下，RH1、RH2、SWS2和LWS基因在第30天的表達量分別為1.69、2.83、3.90、2.74，而在第60天的表達量分別為1.12、1.12、1.05、1.07。由實驗結(jié)果可以看出，在24 h∶0 h條件下RH1、RH2、SWS2和LWS基因的表達量都是降低的。在12 h∶12 h條件下，RH1、SWS2和LWS基因的表達量是增加的。在0 h∶24 h條件下，RH1、RH2和SWS2基因的表達量也是增加的。

3 結(jié)論與討論

視網(wǎng)膜承擔著將光信號轉(zhuǎn)化為電信號并傳遞電信號的作用，當光照的強度和光照的持續(xù)時間超過了其自身所能承受的閾值時，視網(wǎng)膜就會損傷[25]。由本文實驗結(jié)果可以看出，在一定的光照強度下，四指馬鲅在0 h∶24 h、12 h∶12 h和24 h∶0 h的光照周期條件飼養(yǎng)60 d，組織學切片顯示其視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)完整并無明顯差異。而在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)有一定差異。在12 h∶12 h的間歇光照下，第30天和第60天的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無明顯差異，視錐細胞和視桿細胞的外節(jié)和內(nèi)節(jié)均排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。有研究表明，光子被視蛋白吸收時產(chǎn)生自由基，而自由基極易攻擊構(gòu)成膜盤的不飽和脂肪酸的亞甲基結(jié)構(gòu)，進而使膜盤結(jié)構(gòu)以及線粒體等發(fā)生過氧化，從而造成視網(wǎng)膜組織的光性損傷[26]。在正常情況下，視網(wǎng)膜組織能夠使其內(nèi)自由基的含量維持在一定水平，但是當外界條件發(fā)生變化時，視網(wǎng)膜無法維持其內(nèi)自由基的動態(tài)平衡，進而使視網(wǎng)膜受到損傷[27]。在24 h∶0 h的持續(xù)光照條件下，視網(wǎng)膜的視錐視桿層在第30天和第60天有著不同程度的變化。目前還無法明確造成這種結(jié)果的具體機制，可能的原因是，在持續(xù)的光照條件下，視網(wǎng)膜內(nèi)產(chǎn)生了大量的自由基，自由基產(chǎn)生的速率高于其被清除的速率，從而破壞了自由基動態(tài)平衡，進而造成了視網(wǎng)膜膜盤的斷裂和損傷。

SWS1能吸收的入射光的最大光譜范圍在紫外線的光譜范圍內(nèi)，而紫外線在生物的覓食、交流以及配偶選擇等方面起著重要作用[28]。但是，在四指馬鲅眼球組織的轉(zhuǎn)錄組中，并沒有發(fā)現(xiàn)與SWS1基因有關(guān)的序列。有研究發(fā)現(xiàn)，SWS1基因是否存在與該生物生活環(huán)境中是否有紫外光有一定關(guān)系，且一個氨基酸的替換就可以使SWS1蛋白的敏感光譜從紫外光譜向藍紫色光譜偏移[29-33]。四指馬鲅喜棲息于近海、河口及泥沙質(zhì)海底，紫外光等短波長的光在這種水質(zhì)中高度發(fā)散，不能使其形成較好的視覺，因此，四指馬鲅對紫外光的敏感性下降，這有可能是四指馬鲅眼球組織轉(zhuǎn)錄組中沒有檢測到SWS1基因相關(guān)序列的原因。

由于水體環(huán)境復雜多樣，且隨著深度的變化而有著明顯的環(huán)境梯度，其中的入射光光譜會有明顯差別，因此不同梯度水環(huán)境內(nèi)魚類可通過視蛋白的差異表達和視蛋白的復制和分歧來增加視蛋白的多樣性，從而使魚類視覺系統(tǒng)和自適應發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)，麗魚科(Cichlidae)不同種屬間視蛋白的差異表達導致了其視覺系統(tǒng)明顯的種間差異[34]。而群體間的生殖隔離和體色的多樣性有可能是視覺系統(tǒng)對不同區(qū)域光環(huán)境的適應性造成的[35]。如珊瑚礁魚類警戒體色的進化，可能是由于其視蛋白對不同色彩的響應偏差導致的[36]。不同的光照時長，會引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生理活動發(fā)生變化，這種變化傳遞到神經(jīng)中樞，經(jīng)中樞神經(jīng)的分析和整合，使動物的體溫、心率和激素水平發(fā)生改變，同時引起機體生物節(jié)律發(fā)生變化[37]。魚類在海洋和淡水之間遷徙和產(chǎn)卵的行為和生理特性，可能與感覺系統(tǒng)隨個體發(fā)育而變化有關(guān)。本應順流而下的花鰻鱺(Anguillamarmorata)卻在特定時期向上游遷移的行為可能是由于其根據(jù)月亮周期促使其視蛋白差異表達而導致的[38]。不僅僅是繁殖行為，生物的其他行為活動同樣受到光照周期的影響，但這并不是一種短暫的現(xiàn)象，而是生物體在漫長的進化過程中對光照時長的適應性變化。本研究選取0 h∶24 h、12 h∶12 h、24 h∶0 h這三種差別較大的光照周期作為實驗組，研究視網(wǎng)膜感光視蛋白表達量的變化，初步探討視蛋白對光照周期的適應性變化。由實驗結(jié)果可以看出，經(jīng)過不同的光照周期飼養(yǎng)30 d后，RH1、RH2、SWS2和LWS基因在0 h∶24 h和12 h∶12 h這兩組的表達差異均不顯著，而在24 h∶0 h光照條件下則顯著增高。這說明在24 h光照周期中，當光照時長大于暗黑時長時，光照時間的增加能促進RH1、RH2、SWS2和LWS基因的表達。當生物體所處的光環(huán)境發(fā)生變化時，其視覺系統(tǒng)中視錐細胞和視桿細胞所接受的光譜信號就會不同，光敏感性視蛋白的表達量就會隨之變化。而光敏感性視蛋白含量的增高，能夠為生物體提供較好的視覺，從而滿足生物體覓食、躲避敵害等行為活動。養(yǎng)殖60 d后，RH1、SWS2和LWS基因的表達量在12 h∶12 h條件下是最高的，而RH2的則是在0 h∶24 h條件下表達量最高。RH2可能在黑暗或者弱光條件下發(fā)揮了某些重要作用。與第30天相比，這4種視蛋白的基因在不同的光照周期下的表達量有所不同。從總體趨勢看，RH1、SWS2和LWS基因的表達量在0 h∶24 h和12 h∶12 h條件下是增加的，而在不間斷的連續(xù)光照條件下，其表達量反而是降低的。導致這種變化的具體機制目前還并不清楚，但是這變化與武靜等對小鼠的研究結(jié)果相似[39]。武靜等認為視蛋白的表達量在持續(xù)的光照條件下的下降可能是機體為了維持正常的晝夜節(jié)律而做出的一種代償性的減少。雖然本研究結(jié)果的總體趨勢是視蛋白的表達量在持續(xù)的黑暗條件下增加而在持續(xù)的光照條件下降低，但是LWS基因的表達量在持續(xù)的黑暗條件下是降低的，導致與其他視蛋白表達量變化不一致的原因目前并不清楚，可能的原因是LWS對光照強度的敏感性與其他視蛋白不一致。因為本實驗所研究的3個光照周期中0 h∶24 h組的光照強度為0，即是完全無光的，而另外兩組都有光照刺激。但以上推斷還需要有進一步的實驗來證實。