阿奇霉素片微生物限度檢查方法的適用性驗證

瞿燕萍

摘 要 目的：建立大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物阿奇霉素片微生物限度檢查方法并對其進(jìn)行驗證。方法：參照2015年版《中國藥典》四部通則，采用薄膜過濾法測定阿奇霉素片對金黃色葡萄球菌等5種試驗菌種的回收率，并對其進(jìn)行了控制菌適用性試驗。結(jié)果：5種試驗菌回收率均在0.5～2.0范圍，控制菌可檢出。結(jié)論：本試驗所建立方法可用于阿奇霉素片的微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞 阿奇霉素 驗證 微生物限度試驗

中圖分類號：R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）23-0107-04

Applicability validation for the microbial limit test of azithromycin tablets

QU Yanping*

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the microbial limit test of azithromycin tablets and to verify it. Methods： According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles， the recovery rates of azithromycin tablets to 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were determined by membrane filtration and Petri dish cultivation， and the applicability test of Escherichia coli as the control bacterium was also performed. Results： The recoveries of the five tested bacteria ranged from 0.5 to 2.0， and the control bacteria could be detected. Conclusion： The established method can be used for microbial limit test of azithromycin tablets.

KEy WORDS azithromycin； verification； microbial limit test

阿奇霉素（azithromycin）是第一個十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrolide），也是第一個氮雜內(nèi)酯類抗生素（azalide）[1]。其對革蘭陽性菌及厭氧菌有較好的抗菌作用外，對革蘭陰性菌中的流感嗜血桿菌、淋病奈瑟球菌有很強(qiáng)的抗菌作用[2]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為快效抑菌劑，廣泛應(yīng)用于臨床，近些年來，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的發(fā)展較快，尤其是其長效品種的出現(xiàn)，更給該類藥物的臨床應(yīng)用帶來了活力[3]。上海現(xiàn)代制藥股份有限公司自2007年2月生產(chǎn)銷售阿奇霉素片至今，在銷售市場占有一定份額，由于《中國藥典》2015年版摒棄了離心處理獲得供試液，需通過其他處理獲得供試液，供試液中抑菌作用的分散濃度也將直接影響驗證的回收率，故需對該產(chǎn)品重新進(jìn)行微生物限度檢查方法的適用性驗證，同時對其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素?zé)o微生物限度檢查法的建立具有一定的借鑒意義[4]。阿奇霉素片微生物限度檢查包括需氧菌、霉菌和酵母，控制菌選取大腸埃希菌。對具有抗菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時，應(yīng)首先消除其抗菌活性，并通過實驗驗證抗菌活性的去除是否徹底，以保證檢驗結(jié)果的有效性，薄膜過濾法是去除藥品中抗菌成分的最有效方法[5]。同時加入適宜的中和劑也能起到有效降低抑菌性的作用。為保障患者的用藥安全，確立可靠的微生物限度檢驗方法，本試驗參照2015年版《中國藥典》四部通則1105、1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計數(shù)法、控制菌檢查法，對阿奇霉素片微生物限度檢查方法進(jìn)行了摸索與驗證[6]，由于阿奇霉素在同類的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中其抑菌性的強(qiáng)度偏中上，故在驗證中發(fā)現(xiàn)需通過提高供試品溶液的稀釋倍數(shù)，在樣品溶解時加入適宜的中和劑（卵磷脂與吐溫-80）[6]，并在薄膜過濾沖洗液中加入吐溫-80作為增溶劑等方法相結(jié)合，可有效去除大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

阿奇霉素片（上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，規(guī)格0.25 g，批號180304）。

pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（上海盛思生化科技有限公司，批號170801）；蛋黃卵磷脂（博飛美科試劑公司，批號18032）；吐溫-80（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20131016）。

1.2 培養(yǎng)基與菌種

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基（上海盛思生化科技有限公司，批號分別為170801、171109、180103、161201、160701）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， CMCC（B） 26003）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，CMCC（B）-63501）、白色假絲酵母（Candida albicans，CMCC（F）-98001）、黑曲霉（Aspergillus niger，CMCC（F）-98003）和大腸埃希菌（Escherichia coli，CMCC（B）44102）均來自于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 實驗儀器

LRH-150生化培養(yǎng)箱、GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；S20 pH酸度計（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司）； HT-600N電子天平（成都普瑞遜電子有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；1300 SERIES A2生物安全柜（賽默飛世爾科技公司）；YX940D電動吸引器（上海醫(yī)療器械公司醫(yī)用吸引器廠）；JYD-400N均質(zhì)器（上海之信儀器有限公司）；微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠，規(guī)格50 mm，孔徑0.45 mm）。

1.4 實驗方法

參照2015年版《中國藥典》四部通則[5]對阿奇霉素片進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌檢查方法的確認(rèn)，所有試驗均采用薄膜過濾法。

1.4.1 菌液的制備

參照2015年版《中國藥典》四部通則[5]1105微生物計數(shù)法項下方法制備。

將陽性菌菌液稀釋10-3～10-7倍，使菌落數(shù)不大于

100 cfu/ml。

1.4.2 供試液的制備

取阿奇霉素片10 g，粉碎，移至一次性無菌袋中，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（內(nèi)含0.3%卵磷脂與3%吐溫80）100 ml中，用拍打器拍打1 min（拍打速率12下/min），即得阿奇霉素供試液Ⅰ（100 mg/ml）；用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，分別配制成供試液Ⅱ（50 mg/ml）、供試液Ⅲ（20 mg/ml）、供試液Ⅳ（10 mg/ml）、供試液Ⅴ（5 mg/ml）。

1.4.3 計算公式及接受標(biāo)準(zhǔn)

試驗組比值=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)。

所得比值均應(yīng)在0.5～2.0范圍內(nèi)。

1.4.4 微生物總數(shù)計數(shù)方法

1）需氧菌計數(shù)方法的確定（預(yù)試驗） 以金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和銅綠假單胞菌為試驗菌，分別對供試品進(jìn)行處理。①分別取供試液Ⅱ與Ⅲ各1 ml，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗；②取供試液Ⅳ1 ml，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（內(nèi)含0.1%吐溫80）1 000 ml薄膜過濾沖洗；③分別取供試液Ⅳ與Ⅴ各1 ml，采用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（內(nèi)含0.1%吐溫80）1 000 ml薄膜過濾沖洗（最后沖洗100 ml時加入菌懸液）。

2）霉菌和酵母菌計數(shù)方法的確定（預(yù)試驗） 以白色假絲酵母和黑曲霉菌為試驗菌，分別采用2種方法對供試品進(jìn)行處理。①取供試液Ⅰ1 ml平皿法測定；②取供試液Ⅰ1 ml，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（內(nèi)含0.1%吐溫80）1 000 ml薄膜過濾沖洗（最后沖洗100 ml時加入菌懸液）。

1.4.5 微生物計數(shù)驗方法證

經(jīng)過預(yù)試驗，確認(rèn)需氧菌計數(shù)使用方法③，霉菌和酵母菌計數(shù)使用方法②。根據(jù)此結(jié)論進(jìn)行三次平行實驗確認(rèn)。①試驗組：取供試液Ⅴ1 ml，移至pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（內(nèi)含0.1%吐溫80）100 ml中，混勻，過濾，然后用沖洗液沖洗9次，每次100 ml，最后沖洗100 ml時加入1 ml菌液（<100 cfu/ml），濾干，將膜的正面貼于胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基平板，于30～35 ℃培養(yǎng)3～5 d；霉菌和酵母菌同法操作，將膜的正面貼于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基平板，于20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d。②供試品對照組：不加入菌液的供試液，測定供試品微生物數(shù)；③菌液對照組；取稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進(jìn)行回收試驗。

1.4.6 控制菌驗證試驗

以大腸埃希菌作為控制菌采用薄膜過濾法進(jìn)行操作。①試驗組：取供試液Ⅳ100 ml，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗，取濾膜置100 ml TSB中，混勻，同時加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻；②陰性對照組：取pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗后的濾膜置TSB 100 ml中；③菌液組：取TSB 100 ml加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻。均按藥典方法培養(yǎng)，以接入試驗組的大腸埃希菌被檢出為接受標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法的預(yù)實驗

5種預(yù)實驗結(jié)果表明，方法③可用于需氧菌總數(shù)的計數(shù)（表1）。

2.2 氧菌總數(shù)計數(shù)方法驗證

按照方法③對一批供試品進(jìn)行平行三次驗證試驗，結(jié)果表明方法③可用于阿奇霉素片需氧菌總數(shù)計數(shù)（表2）。

2.3 真菌總數(shù)的預(yù)實驗

兩種預(yù)實驗方法試驗結(jié)果表明，方法②可用于霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)（表3）。

2.4 真菌總數(shù)方法驗證

按照方法②對一批供試品進(jìn)行平行三次驗證試驗，結(jié)果表明采用方法②可用于阿奇霉素片霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)（表4）。

2.5 控制菌驗證試驗

控制菌選用稀釋10-6倍的大腸埃希菌，一批供試品進(jìn)行平行三次驗證，結(jié)果為試驗組和陽性組均檢出大腸埃希菌生長，而陰性組均未檢出，表明適用性試驗符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

通過上述一系列試驗，成功摸索出了適合阿奇霉素片的微生物限度控制方法，由于本次驗證中通過拍打器拍打樣品獲得供試液，拍打器處理使產(chǎn)品的抑菌成分更好的分散開來，除了通過中和劑與薄膜過濾的聯(lián)用起到抑菌作用外，在稀釋液內(nèi)增加吐溫80與驗證中菌液的加入時間也會提高驗證回收率，但需注意：一是由于沖洗液內(nèi)含有0.1%吐溫80，故在進(jìn)行薄膜過濾時濾膜盡量抽濾充分后進(jìn)行培養(yǎng)，防止菌落出現(xiàn)連片現(xiàn)象，從而影響計數(shù)觀察；二是由于產(chǎn)品的抑菌性較強(qiáng)，故試驗用菌懸液需在薄膜過濾中最后沖洗100 ml時加入。

抗菌藥物含有較強(qiáng)的抑菌成分，使用正確的方法消除其抑菌成分，提高微生物的檢出率是至關(guān)重要的[7]。檢查方法中干擾因素較多，易影響計數(shù)結(jié)果，如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、加菌濃度及加菌量等[8-9]。藥品微生物計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（MPN法），供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法應(yīng)盡量選擇微生物培養(yǎng)中操作簡便、快速的方法，對于抑菌作用較強(qiáng)的供試品，應(yīng)盡量選用薄膜過濾法進(jìn)行試驗[6]。本次驗證中阿奇霉素片是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物，具有較強(qiáng)的抑菌性，通過各種處理，確定消除藥品的抑菌性后再進(jìn)行微生物限度檢查是檢驗方法篩選的基本原則[10]，同時在預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)，薄膜過濾沖洗液內(nèi)添加0.1%的吐溫80可起到增溶作用，使用適宜的中和劑也可有效降低產(chǎn)品的抑菌效果，并在適用性試驗時對供試液進(jìn)行更高倍數(shù)的稀釋[5]，故在本次驗證中通過提高稀釋倍數(shù)+中和劑+薄膜過濾來進(jìn)行驗證。

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