抗氧化劑對寒富蘋果酒發(fā)酵過程成分及抗氧化性的影響

張雨茜，顏廷才，張 娟，史 琳，孟憲軍

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，沈陽 110161）

寒富蘋果是由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)選擇培育出的抗寒性極強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)蘋果品種[1]，其果實具有個大整齊、酥脆多汁的特點，同時相較于富士等品種，表現(xiàn)出了極好的耐貯藏性[2-4]。近年來，寒富蘋果在全國各地得到了廣泛的種植，寒富蘋果的種植面積不斷擴(kuò)大、產(chǎn)量不斷增加，價格卻一路走低。為解決這一生產(chǎn)矛盾，保護(hù)廣大農(nóng)戶的利益，開展寒富蘋果深加工研究十分必要[5]。蘋果酒是蘋果原汁經(jīng)過發(fā)酵得到的一種低酒精度的果酒[6]，蘋果酒保留了蘋果原有的糖類、氨基酸、礦物質(zhì)以及蘋果特有的有機(jī)酸等物質(zhì)，同時富含具有抗氧化活性的酚類物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，具有保健功效[7-9]。目前，國內(nèi)外的消費者越來越青睞于蘋果酒等低酒精度果酒[10]，這就使生產(chǎn)寒富蘋果酒成為寒富蘋果加工利用的新方向。

蘋果酒生產(chǎn)中的氧化褐變問題是影響其品質(zhì)的重要因素，在果酒生產(chǎn)中常通過添加抗氧化劑的方法阻止酒體的劣變[11]。目前，國內(nèi)外常用的抗氧化劑有很多，本試驗選用的5種抗氧化劑在果蔬保鮮加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。維生素C，又稱抗壞血酸，作為一種多糖化合物，它本身就具有很強(qiáng)的抗氧化能力，還作為鮮水果品質(zhì)的重要衡量指標(biāo)，同時在鮮切水果保鮮[12-13]、果酒防褐變方面[14-15]均有突出貢獻(xiàn)；賴氨酸可有效延長鮮切果蔬貨架期，有效控制鮮切菠菜細(xì)菌含量，有很好的護(hù)色抗氧化作用[16-17]，其參與美拉德反應(yīng)后的產(chǎn)物有很大抗氧化活性[18]；葡萄糖氧化酶具有酶的專一性，同時有天然無污染的特點，被廣泛應(yīng)用于果汁[19]、果酒[20]釀造中，起到防止褐變，延長保質(zhì)期的作用；而氯化鈉和檸檬酸也在保鮮和果酒抗氧化方面有很多應(yīng)用，蘋果酒中加檸檬酸可有效控制美拉德反應(yīng)，防止褐變發(fā)生[21-22]；氯化鹽有較好的果蔬護(hù)色效果，其能力堪比稍貴的抗壞血酸鹽，可成為其低價替代品[23]，但根據(jù)學(xué)者們的相關(guān)研究總結(jié)，1%～1.5%(w/v)才能起到很好的抗氧化及護(hù)色作用。本試驗將寒富蘋果作為原材料，通過研究不同抗氧化劑對蘋果果酒釀造過程中營養(yǎng)成分及酚類物質(zhì)與其抗氧化活性的影響，選擇合適的抗氧化劑用于寒富蘋果酒的生產(chǎn)，進(jìn)而達(dá)到推動寒富蘋果酒發(fā)酵向有利方向發(fā)展的目的，為市場提供營養(yǎng)豐富的蘋果酒新品；同時，可解決寒富蘋果的產(chǎn)量過剩的問題，提高寒富蘋果種植經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)寒富蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：寒富蘋果，2016年10月9日購于沈陽市東陵區(qū)深井子金德勝果園，表面全部轉(zhuǎn)紅，完全成熟，大小不分級，運回實驗室5℃冷庫中存貯。

主要試劑：白砂糖（廣州福正東海食品有限公司）；活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；福林酚試劑、一水合沒食子酸[鼎瑞化工（上海）有限公司]；無水乙醇、焦亞硫酸鈉、賴氨酸、維生素C、檸檬酸、氯化鈉、葡糖氧化酶、碳酸鈉(沈陽沈一精細(xì)化學(xué)品有限公司)；總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒、二苯基三硝基苯肼（DPPH）、總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）(上海鼎國生物技術(shù)有限公司)。

主要儀器：MJBL25B26榨汁機(jī)(廣州美的集團(tuán)股份有限公司)；AE523電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；pH7110/7310實驗室臺式pH/mV測試儀(上海邦沃儀器設(shè)備有限公司)；JC510-AY32手持式糖度折光儀(北京百萬電子科技有限公司)；Q-250ES超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV1902PC紫外可見分光光度計(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；KXW-80A旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；全波長酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 寒富蘋果酒試驗處理 將寒富蘋果從冷庫中取出后置于22℃室溫，清洗后，通心去核，切分后榨汁處理。為使榨出蘋果汁初始成分相同，對蘋果汁進(jìn)行成分調(diào)整。試驗中寒富蘋果榨汁后的糖度為140g·L-1，通過添加白砂糖的方式調(diào)整蘋果汁糖度至220g·L-1?；靹蚝?，分裝于發(fā)酵瓶中，每瓶2L。5瓶分別添加1g·L-1NaCl、1g·L-1檸檬酸（citric acid，CA）、200mg·L-1Vc、200mg·L-1Lys、200mg·L-1葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）作為 5 個處理組，原汁發(fā)酵作為對照組，再分別添加200mg·L-1安琪活性干酵母（需要提前0.5h用10倍溫水活化，添加10%蔗糖，讓酵母充分生長，有酸味與氣泡產(chǎn)生），混勻后置于室溫（22℃）、避光條件下進(jìn)行靜置發(fā)酵。每天觀察發(fā)酵情況，每天至少搖晃2～3次，每5d測定1次指標(biāo)，20d后過濾，倒罐進(jìn)行后發(fā)酵。

各抗氧化劑使用量是通過大量文獻(xiàn)閱讀參考后確定的，其中氯化鈉和檸檬酸使用量稍多，是由于氯化鈉和檸檬酸使用量需達(dá)到1%～2%(w/v)才能起到較好的護(hù)色抗氧化作用，而考慮到氯化鈉和檸檬酸自身味感對酒體口感的影響，選擇添加濃度為1g·L-1，這樣既能保證抗氧化效果同時又不影響蘋果酒口感。

1.2.2 酒精計法測定酒精度 參照GB/T 15038-2006中果酒酒精度的測定方法[24]。

1.2.3 手持式糖度折光儀測定可溶性固形物的測定 取待測發(fā)酵液數(shù)滴，置于手持式糖度折光儀的檢測棱鏡上，將儀器進(jìn)光板對準(zhǔn)光源進(jìn)行讀數(shù)測定。測定時應(yīng)注意用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零后再測量，測定過程中注意避免氣泡的產(chǎn)生，同時注意測定時的溫度校正。

1.2.4 福林酚法測定總酚含量 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：首先配制1000mg·L-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用蒸餾水稀釋配備質(zhì)量濃度為0，10，20，30，40，50mg·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。避光條件下用移液槍分別移取6種質(zhì)量濃度不同的1mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個試管中，分別依次加入蒸餾水5mL、等體積稀釋后的FC試劑1mL、7.5%的Na2CO33mL，用渦旋混合器進(jìn)行均質(zhì)。顯色90min后，用紫外分光光度計于765nm波長下測定吸光值，重復(fù)3次。以吸光度值為縱坐標(biāo)，一水合沒食子酸含量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

寒富蘋果酒中總酚含量的測定：取寒富蘋果酒發(fā)酵液50mL于燒杯中，加入150mL的無水乙醇，使用超聲波進(jìn)行輔助提取10min，之后靜置30min，將所得溶液抽濾后在45℃下旋蒸至干燥后，乙醇溶解定容至50mL后抽濾，制成各處理多酚提取液。取寒富蘋果多酚提取液1mL，按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測得各寒富蘋果酒發(fā)酵液樣品的吸光值，代入回歸方程后可計算出總酚的含量，每組樣品重復(fù)3次。

1.2.5 DPPH法測定清除自由基能力 參考呂春茂等[25]的方法并略加修改。

寒富蘋果酒發(fā)酵液作為待測樣本，按照表1依次向A0，Ai，Aj試管中加入相應(yīng)試劑再進(jìn)行測定。其中DPPH溶液的制備，需要準(zhǔn)確稱取0.1984g DPPH，用無水乙醇溶解定容至250mL，再取10mL定容后的液體，用無水乙醇稀釋至100mL作為DPPH待用液。充分混勻后室溫靜置30min，用紫外分光光度計于734nm波長下測量試管 A0、Ai、Aj對應(yīng)吸光度（OD）值 D0、Di、Dj，注意測定前用蒸餾水調(diào)零，平行測定3次。計算公式為：

表1 DPPH法清除自由基能力測定方法Table 1 DPPH method for testing of free radical scavenging capacity /mL

1.2.6 T-AOC法測定總抗氧化能力 取寒富蘋果發(fā)酵液作為待測樣本，對照管添加樣本為蒸餾水。根據(jù)試劑盒測定方法按照表2加入相應(yīng)溶劑，配制成應(yīng)用液?；旌显噭┦怯稍噭┮弧⒃噭┒?、試劑三按照1∶2∶0.5的比例配制而成，其中試劑二為白色晶體，使用前需用120mL雙蒸水溶解，混合試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配，注意添加完混合試劑后要用渦旋混合器充分混勻，并于37℃水浴30min。所有溶劑添加完后室溫反應(yīng)10min，用紫外分光光度計于520nm波長處分別測出對照管和測定管對應(yīng)的吸光度（OD）值，注意測定前用雙蒸水進(jìn)行調(diào)零，平行測定3次。37℃條件，每分鐘反應(yīng)體系由于每毫升的樣品加入，吸光度值增加0.01時，可作為一個總抗氧化能力的單位。計算公式為：

1.2.7 ABTS法測定總抗氧化能力 取寒富蘋果發(fā)酵液作為待測樣本，根據(jù)試劑盒方法按照表3依次向?qū)?yīng)孔位加入試劑，進(jìn)行測定。ABTS工作液是由ABTS工作母液（ABTS溶液∶氧化劑溶液=1∶1混合均勻后室溫下避光放置14h）用80%乙醇稀釋45倍得到的，注意現(xiàn)用現(xiàn)配。所有試劑添加完成后于室溫條件下孵育3min，用酶標(biāo)儀于734nm處測定各孔對應(yīng)吸光度（OD）值，平行測定3次。以總抗氧化能力（不同Trolox標(biāo)準(zhǔn)品濃度）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)孔對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測樣本對應(yīng)測定孔OD值代入方程，得到寒富蘋果發(fā)酵液的總抗氧化能力。

表2 T-AOC法總抗氧化能力測定方法Table 2 T-AOC method for testing of total antioxidant capacity /mL

表3 ABTS法總抗氧化能力測定方法Table 3 ABTS method for testing of total antioxidant capacity /μL

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑對寒富蘋果酒發(fā)酵過程可溶性固形物變化的影響

由圖1可知，添加NaCl、Lys、Vc、CA、GOD這5種抗氧化劑處理與不添加任何抗氧化劑的原汁發(fā)酵CK組相比，可溶性固形物變化規(guī)律基本相似。可溶性固形物含量總體呈下降趨勢，從初始的22%，發(fā)酵15d內(nèi)快速降至2.2%，之后變化緩慢，發(fā)酵20d基本在2.0%。這是因為蘋果酒的發(fā)酵過程中對糖類物質(zhì)的消耗主要是微生物促使葡萄糖等有機(jī)物向酒精轉(zhuǎn)變，與此同時，氨基酸和蛋白質(zhì)等含氨基的物質(zhì)也會與糖類物質(zhì)反應(yīng)，使可溶性固形物減少。由圖1還可知，加入抗氧化劑發(fā)酵的前5d，添加Vc與Lys兩組的可溶性固形物含量下降緩慢，添加Vc后的5d，可溶性固形物含量只減少3.8%，添加Lys后可溶性固形物含量降低5.4%，而其他組與對照組無明顯差異，可溶性固形物含量降低7%?？梢姡@5種抗氧化劑除Vc前期可明顯減緩可溶性固形物消耗速度外，其他處理對可溶性固形物的發(fā)酵影響不大。

2.2 抗氧化劑對寒富蘋果酒發(fā)酵過程酒精度變化的影響

酒精是果酒的主要成分，也是果酒區(qū)別于果汁的重要成分之一，同時酒精的生成速度是檢驗果酒發(fā)酵過程是否順利的重要指標(biāo)。由圖2可知，添加5種抗氧化劑處理組與對照組相比，酒精生成規(guī)律基本相似，同時生成趨勢也與可溶性固形物的消耗趨勢表現(xiàn)出了契合性，酒精度在前10d快速升高至7.0%vol，10～15d生成速度減緩，15d達(dá)到8.0%vol以后酒精度基本不再變化，標(biāo)志著發(fā)酵過程的基本結(jié)束。相比之下，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵的前5d，Vc、CA及GOD處理組與CK相比，酒精濃度升高緩慢，Vc處理組在發(fā)酵的前5d酒精生成量只有2.3%vol，CA、GOD組酒精生成量在2.5%vol，而對照組自然發(fā)酵條件下酒精生成量在4.2%vol。經(jīng)過20d的發(fā)酵，NaCl、Lys處理組合CK組的酒精度達(dá)到8.5%vol，而經(jīng)過CA和GOD處理后，酒精度只有8.0%vol，但可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束時，添加抗氧化劑組與對照組最后的酒精度均穩(wěn)定在8.3%vol，可見，添加Vc、Lys及GOD這3種抗氧化劑可以在發(fā)酵前期減緩酒精生成速度，但并不影響寒富蘋果酒正常的發(fā)酵進(jìn)程。

2.3 抗氧化劑對蘋果酒發(fā)酵過程中色澤的影響

圖1 抗氧化劑對發(fā)酵過程可溶性固形物的影響Figure 1 Effect of antioxidants on total soluble solid during fermenting process

圖2 抗氧化劑對發(fā)酵過程乙醇生成的影響Figure 2 Effect of antioxidants on alcohol generating during fermenting process

由圖3可知，寒富蘋果酒發(fā)酵過程中其顏色逐漸變淺，發(fā)酵液逐漸變得清澈透明。添加抗氧化劑當(dāng)天，Vc組的護(hù)色效果明顯優(yōu)于其他處理組和對照組，蘋果汁呈現(xiàn)黃色，其他抗氧化劑處理組都呈現(xiàn)黃褐到褐色。在發(fā)酵的0～5d，發(fā)酵液開始有氣泡產(chǎn)生，同時酒體中存在大量絮狀物。到了發(fā)酵的5～10d，蘋果汁顏色逐漸變淺，絮狀物逐漸減少，但由于酒體的渾濁，各個抗氧化劑處理之間顏色差異不明顯。發(fā)酵15d后，發(fā)酵過程變得非常緩慢，氣泡明顯減少，果渣基本沉淀到底部，顏色明顯變淺。發(fā)酵20d后，發(fā)酵基本停止，離心過濾處理后酒體澄清，顏色以淺黃到淺黃褐色。此時各處理組與對照組顏色差異不明顯，可以看到CA處理組護(hù)色效果稍好一點，同時發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期表現(xiàn)出良好護(hù)色效果的Vc處理組，在后續(xù)發(fā)酵過程中護(hù)色效果逐漸減弱。

圖3 抗氧化劑對發(fā)酵液色澤的影響Figure 3 Effect of antioxidants on color during fermenting process

2.4 抗氧化劑對寒富蘋果酒發(fā)酵過程中總酚含量的影響

由圖4可知，曲線的回歸方程為y=0.005x+0.0814，R2=0.9997，說明在總酚含量在 0～35mg·L-1之間，吸光度值與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計算出樣品中總酚的含量。

由圖5可知，寒富蘋果酒發(fā)酵過程中Vc、Lys及GOD處理組和對照組總酚含量變化規(guī)律一致，呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。Vc處理組總酚含量明顯高于其他組，在發(fā)酵初期達(dá)到560mg·L-1，總酚含量比CK組高263mg·L-1，發(fā)酵5d后上升到707mg·L-1，發(fā)酵20d后含量降低到231mg·L-1，但總酚含量仍比其他處理組高112～55mg·L-1；Lys與CA處理組在發(fā)酵初期總酚初始含量是320mg·L-1，與其他幾組表現(xiàn)不同的是，在后續(xù)發(fā)酵過程中總酚含量持續(xù)下降，未出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，到20d后總酚含量降低到120mg·L-1；所有組在寒富蘋果酒發(fā)酵的5～20d總酚含量的持續(xù)下降，同時在發(fā)酵的5～10d之間下降速度較快。總體看來，Vc處理組總酚含量遠(yuǎn)高于其他處理組，Vc是5種抗氧化劑中對總酚保護(hù)作用表現(xiàn)最突出的。

2.5 抗氧化劑對寒富蘋果發(fā)酵液清除DPPH自由基能力的影響

寒富蘋果酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力總體呈現(xiàn)下降趨勢，不同處理組的清除DPPH自由基能力變化規(guī)律不明顯，清除率在94.62%到80.42%之間波動，其效果如圖6。由圖6可知，NaCl與CA抗氧化劑處理能夠提高初始的DPPH自由基清除能力，清除率初始值最高的是CA處理，為94.62%；其次是NaCl的92.08%，其他處理與對照接近89%。發(fā)酵10d時，NaCl處理與CA處理清除率急劇下降；NaCl處理清除率降低到最小值80.42%，CA處理清除率降低到最低值83.52%，之后這兩個處理的DPPH自由基清除能力又有所升高；其他處理清除率一般90%，保持平穩(wěn)下降趨勢。Vc處理組在整個過程中都表現(xiàn)出極好的清除能力，且發(fā)酵20d時，Vc處理清除率最高，為88.07%，清除率最低的是Lys處理，為82.07%。發(fā)酵結(jié)束后，只有Vc處理清除率基本不變，其他處理都有所降低。同時值得注意的是，雖然NaCl處理組清除DPPH自由基的能力波動性很大，但在20d發(fā)酵結(jié)束時，清除效果僅次于Vc。寒富蘋果酒發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力結(jié)果與總酚含量總體變化上具有一致性，但是沒出現(xiàn)第5d時，清除率隨含量急劇升高的現(xiàn)象，這個過程的具體原因還需要進(jìn)一步探索。

圖4 一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 4 Standard curve of gallic acid

圖5 抗氧化劑對發(fā)酵過程中總酚含量的影響Figure 5 Effect of antioxidants on total polyphenol during fermenting process

2.6 抗氧化劑對寒富蘋果發(fā)酵液T-AOC法總抗氧化能力的影響

寒富蘋果酒發(fā)酵過程中，使用T-AOC法測定發(fā)酵液對Fe3+的還原能力作為發(fā)酵液的總抗氧化能力。測定結(jié)果中總抗氧化能力總體呈先升高后下降的趨勢，與總酚含量變化趨勢相同，最大值出現(xiàn)在發(fā)酵第5d時；發(fā)酵20d時，總抗氧化能力與初始值接近；各抗氧化劑的添加對寒富蘋果酒還原Fe3+的能力影響較大。由圖7可知，發(fā)酵初期，添加Vc的處理組還原Fe3+的能力最強(qiáng)，為23.67U·mL-1；對照處理最低，為6.97U·mL-1；其他處理組的總還原能力為11U·mL-1。發(fā)酵到第5d時，Vc處理的Fe3+還原能力達(dá)到50.63U·mL-1峰值；其次是CA處理，為38.43U·mL-1；最低的是Lys處理，為23.55U·mL-1。隨著發(fā)酵進(jìn)行，寒富蘋果酒的總抗氧化能力逐漸下降，Vc與CA處理下降幅度較大，Lys處理下降幅度最小。發(fā)酵到20d時，還原Fe3+能力最低的CA處理，為9.13U·mL-1；其次是 Lys處理，為 9.62U·mL-1；最高的是 NaCl處理，為 19.31U·mL-1。整個發(fā)酵過程，NaCl、GOD 與對照處理總抗氧化能力比初期升高，漲幅最大的是NaCl處理，升高了44%；Vc、Lys與CA處理總體抗氧化性比初始值降低，降低最多的是Vc處理，由最初的23.67U·mL-1下降到12.45U·mL-1，下降47%。

圖6 抗氧化劑對發(fā)酵過程中果酒清除DPPH自由基能力的影響Figure 6 Effect of antioxidants on scavenging ability of DPPH free radical during fermenting process

圖7 抗氧化劑對發(fā)酵過程中T-AOC法總抗氧化能力的影響Figure 7 Effect of antioxidants on total antioxidant capacity of T-AOC during fermentation

2.7 抗氧化劑對寒富蘋果發(fā)酵液清除ABTS+·的能力的影響

由圖8可知，曲線的回歸方程為y=0.2083x+0.08，R2=0.9998，說明總抗氧化能力（Trolox濃度）在0～1.5mM范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系?？筛鶕?jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出寒富蘋果酒待測樣品的ABTS總抗氧化能力。

通過測定寒富蘋果酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液清除ABTS+·的能力來觀察其總抗氧化能力的變化趨勢。由圖9可知，各個處理的發(fā)酵液清除ABTS+·的能力在發(fā)酵過程中，整體呈現(xiàn)下降趨勢，下降幅度較小，變化趨勢比較平緩。發(fā)酵初期各個處理之間清除ABTS+·能力差異比較顯著，最高的是Vc處理，達(dá)到0.99mM，其次是NaCl處理，為0.87mM，最低的是對照處理，為0.44mM。Vc與NaCl處理組的清除ABTS+·能力始終處于較其他處理高的水平。對照處理在發(fā)酵5d，Vc，CA，GOD處理在發(fā)酵15d時，ABTS抗氧化能力有小幅升高過程，差異最大的Vc處理，升高0.1mM，其他兩個處理升高幅度只有0.05mM。發(fā)酵20d時，Vc處理仍然是最高的，達(dá)到0.63mM，其次也還是NaCl處理，為0.56mM，最低的是Lys處理，清除ABTS+·能力只有0.3mM。對照、CA及GOD處理都在0.38mM?？梢姡寡趸瘎┨幚碓鰪?qiáng)了寒富蘋果酒中發(fā)酵液清除ABTS+·能力，尤其是Vc處理能明顯提高發(fā)酵液的總抗氧化能力。

圖8 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 8 Trolox standard curve

圖9 抗氧化劑對發(fā)酵過程中ABTS總抗氧化能力的影響Figure 9 Effect of antioxidants on total antioxidant capacity of ABTS during fermentation

3 討論與結(jié)論

寒富蘋果酒的發(fā)酵過程中，可溶性固形物含量下降速度和酒精的生成速度，是反映其發(fā)酵進(jìn)程的重要指標(biāo)。結(jié)果表明，發(fā)酵的前5d，Vc處理和Lys處理不同程度上減緩了可溶性固形物的消耗速度，這是由于可溶性固形物主要是指可溶性糖類，也包括水溶性的維生素、礦物質(zhì)等，Vc自身也可被檢測出，因此出現(xiàn)Vc處理延緩發(fā)酵前期可溶性固形物下降速度現(xiàn)象；而Lys處理組產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是Lys含有氨基，添加到酒體中，使酒體中氨基與羰基的比例增大，不利于羰氨反應(yīng)的進(jìn)行[26-27]，暫時性的減緩了對糖類物質(zhì)的消耗。同時發(fā)酵的前5d，Vc、Lys及GOD處理組減緩了蘋果酒的酒精生成速度，通過對可溶性固形物變化的分析，Lys和Vc減緩了可溶性固形物的消耗速度，自然乙醇的生成速度也會變慢；而GOD處理組可溶性固形物消耗速度沒有出現(xiàn)減緩的現(xiàn)象，乙醇生成速度卻出現(xiàn)了明顯的減緩趨勢，是由于GOD可將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸，生成酵母無法利用的營養(yǎng)物質(zhì)[28-29]，與此同時只有酵母消耗的葡萄糖轉(zhuǎn)化成了乙醇，才產(chǎn)生了這種不一致現(xiàn)象。但經(jīng)過20d的發(fā)酵后，添加抗氧化劑和對照組的可溶性固形物含量及酒精含量無明顯差異，這表明添加抗氧化劑不會影響寒富蘋果酒的正常發(fā)酵。

蘋果酒的色澤是評價蘋果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，由于在蘋果破碎過程中會混入氧氣，而蘋果中又富含多酚物質(zhì)，在多酚氧化酶（PPO）的作用下，生成鄰醌等物質(zhì)，再進(jìn)一步與酚類物質(zhì)或氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生縮合反應(yīng)生成褐色物質(zhì)，嚴(yán)重影響蘋果酒的品質(zhì)[30-31]，因此要通過添加抗氧化劑的方式抑制酚類物質(zhì)氧化褐變的發(fā)生，保證酒體的良好色澤。結(jié)果表明，Vc在發(fā)酵前期表現(xiàn)出極好的護(hù)色功能，這是由于Vc通過鈍化金屬離子的方式抑制PPO的活性，同時Vc優(yōu)先自氧化優(yōu)于酚類物質(zhì)，抑制酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生[32-33]，保護(hù)酒體顏色，而到了發(fā)酵后期Vc處理組顏色逐漸加深，這可能是因為Vc穩(wěn)定性較差，對溫度比較敏感，在整個發(fā)酵過程中逐漸被氧化，抑制褐變能力沒有初期明顯。發(fā)酵的20d，CA處理組由于酸性物質(zhì)的加入降低了酒體的pH，營造的酸性環(huán)境不利于PPO的活性，同時CA螯合PPO活性位點上的Cu2+，抑制PPO活性，從而起到護(hù)色、防止褐變的作用[34-35]，使酒顏色更清透。Vc處理對蘋果酒發(fā)酵前期抑制褐變效果明顯，后續(xù)能力減弱，CA抑制褐變的能力緩慢但可持續(xù)性進(jìn)行，兩者在護(hù)色方面表現(xiàn)都很突出。若對寒富蘋果汁進(jìn)行護(hù)色，建議采用Vc處理；對于寒富蘋果酒護(hù)色，由于發(fā)酵過程本身是氧化又還原過程，會把多數(shù)酚類物質(zhì)重新還原，變成無色酚類，可以不用添加抗氧化劑，若想保持較好地色澤，可以適當(dāng)添加Vc或CA。

酚類物質(zhì)對蘋果酒的品質(zhì)起著決定性的作用，是蘋果酒的主要活性物質(zhì)，其含量的變化影響蘋果酒的色澤、口感與風(fēng)味，同時由于其自身具有抗氧化的作用，增強(qiáng)了蘋果酒的功能性[36-38]，因此在寒富蘋果酒發(fā)酵過程中要盡可能保留有利酚類物質(zhì)，提高寒富蘋果酒品質(zhì)。結(jié)果表明，發(fā)酵過程中蘋果酒總酚含量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，不同學(xué)者在對獼猴桃酒、桑葚酒和木瓜酒的發(fā)酵過程中總酚含量的研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的變化規(guī)律[39-42]，分析其原因可能是發(fā)酵初期酒精發(fā)酵營造的乙醇環(huán)境促進(jìn)了酚類物質(zhì)的溶出，使總酚含量升高，之后酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中被消耗或氧化，使得含量下降；Vc處理組總酚含量明顯高于其他組，這可能是由于Vc自身可以與FC試劑反應(yīng)，增加了765nm處吸光值，導(dǎo)致測得的總酚含量增加，但Vc添加量只有200mg·L-1，而與對照相比其總酚增加量遠(yuǎn)高于200mg·L-1，因此另一個主要原因就是Vc通過優(yōu)先自氧化方式保護(hù)酚類物質(zhì)，同時將酚類物質(zhì)氧化初期產(chǎn)生的鄰醌還原為原來的酚類化合物，從而使總酚含量增加；Lys與CA處理組在發(fā)酵過程中總酚變化趨勢上表現(xiàn)出了異常性，這是由于Lys在發(fā)酵前期減緩了酒精的生成速度，阻礙酚類物質(zhì)從果肉中浸提出來，CA也影響了酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，使總酚含量未出現(xiàn)升高性波動而是持續(xù)降低；同時發(fā)酵后期總酚含量的持續(xù)降低也印證了BENVENUTTIA等[43-44]對蘋果酒的研究。

寒富蘋果酒發(fā)酵過程中的抗氧化能力變化也是寒富蘋果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，總抗氧化能力越強(qiáng)，越能表現(xiàn)出產(chǎn)品的功能性。本試驗用3種方法體現(xiàn)寒富蘋果酒的總抗氧化能力，清除DPPH自由基能力方面，寒富蘋果酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力總體呈現(xiàn)下降趨勢，程拯艮對蘋果酒發(fā)酵過程中的DPPH能力的測定，發(fā)現(xiàn)在0～12d時明顯下降，在12～25d時下降緩慢，這與本試驗的試驗結(jié)果的變化趨勢類似[45]，李國薇在其對不同蘋果品種釀造的蘋果酒DPPH自由基清除能力的測定中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中清除能力總體會呈下降趨勢，清除率在80～95%之間[46]，這一數(shù)值也與本實驗結(jié)果吻合；NaCl與CA抗氧化劑處理能夠提高初始的DPPH自由基清除能力，發(fā)酵初期CA提供的酸性環(huán)境，抑制了酶活性，而NaCl屬于強(qiáng)極性分子，可以使酶失活，可能在一定程度上保護(hù)了具有抗氧化性的酚類物質(zhì)不被氧化，從而在初期提高DPPH自由基清除率；Vc處理組在整個過程中都表現(xiàn)出極好的清除能力，同時在發(fā)酵結(jié)束后，只有Vc處理清除率基本不變，其他處理都有所降低，可能是由于Vc自身作為底物被消耗，保護(hù)了酚類物質(zhì)不被氧化，使發(fā)酵液有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力[47]。使用T-AOC法測定發(fā)酵液的總抗氧化能力，結(jié)果表明，發(fā)酵液還原Fe3+呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，與總酚含量變化波形一致，發(fā)酵初期Vc處理組總抗氧化能力明顯高于其他組，這是由于Vc本身具有Fe3+還原特性能力外，還作為氧化底物被消耗保護(hù)了酚類物質(zhì)，提高了發(fā)酵液的總抗氧化能力；整個發(fā)酵過程，NaCl、GOD與對照處理總抗氧化能力比初期升高，漲幅最大的是NaCl處理，這可能是由于NaCl處理后抑制PPO及其他參與酚類物質(zhì)后續(xù)氧化的酶活性，維持了酚類物質(zhì)含量，從而提高發(fā)酵液總抗氧化能力；同時本試驗結(jié)果與其他學(xué)者的研究變化趨勢基本相同，但增長趨勢略有差異[46]，這可能是所用蘋果原料不同導(dǎo)致的。而各個處理的發(fā)酵液清除ABTS+·的能力在發(fā)酵過程中，整體呈現(xiàn)下降趨勢，下降幅度較小，變化趨勢比較平緩，發(fā)酵初期各處理組間差異顯著，同時Vc處理組的清除ABTS+·能力遠(yuǎn)高于其他組?？傮w看來，抗氧化劑Vc的添加對寒富蘋果酒發(fā)酵過程的抗氧化能力有很大的改觀，提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。

本研究在寒富蘋果酒發(fā)酵過程中添加不同抗氧化劑（NaCl、Lys、Vc、CA、GOD），探尋寒富蘋果酒發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)變化規(guī)律同時，探究不同抗氧化劑處理對寒富蘋果酒發(fā)酵過程的影響。寒富蘋果酒在發(fā)酵過程中會發(fā)生一系列物理化學(xué)變化，我們直觀的看到其發(fā)酵液由渾濁逐漸變?yōu)槌吻?，發(fā)酵的0～5d寒富蘋果酒發(fā)酵液上部會出現(xiàn)大量絮狀物，而5～15d期間絮狀物會陸續(xù)下沉，到發(fā)酵的20d時絮狀物逐漸消失沉到發(fā)酵罐底部；與此同時發(fā)酵液的可溶性固形物、酒精、總酚等物質(zhì)含量也發(fā)生了變化?？寡趸瘎┑奶砑訉惶O果酒發(fā)酵液的可溶性固形物、酒精度影響較小，不影響發(fā)酵的正常進(jìn)行；不同種類抗氧化劑的添加對發(fā)酵液顏色有不同的影響，發(fā)酵初期發(fā)酵液顏色呈現(xiàn)深褐色，添加Vc處理后，發(fā)酵液顏色較好，呈黃色；發(fā)酵中期發(fā)酵液顏色相差無幾，呈現(xiàn)黃褐色；而發(fā)酵末期一般呈現(xiàn)禾桿黃，此時各處理組差異不顯著，添加Vc和CA都能對寒富蘋果酒起到護(hù)色的效果；添加Vc可顯著提高總酚的測定結(jié)果，會作為底物參與氧化反應(yīng)，對酚類物質(zhì)起到了很好的保護(hù)作用；本研究通過測定發(fā)酵液在發(fā)酵過程中，各組處理清除DPPH能力、T-AOC法的Fe3+還原能力以及清除ABTS+·能力來評價不同抗氧化劑處理對寒富蘋果酒抗氧化能力的影響。各處理組清除DPPH自由基的能力整體呈下降趨勢，不同處理組的清除DPPH自由基能力變化規(guī)律不明顯，清除率在94.62%到80.42%之間波動。酒體的Fe3+還原能力在發(fā)酵整個過程中都出現(xiàn)先增強(qiáng)后降低的波動現(xiàn)象，其中Vc處理后的發(fā)酵液抗氧化能力最強(qiáng)，這與總酚變化規(guī)律具有一致性。酒體清除ABTS+·能力在發(fā)酵期間總體呈現(xiàn)下降趨勢，存在小范圍的波動，Vc處理能提高清除ABTS+·能力。綜上所述，不同抗氧化劑的使用對寒富蘋果酒發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)及抗氧化活性影響較大的是Vc，同時在寒富蘋果酒的護(hù)色方面也有較好的表現(xiàn)。因此，未來可以考慮Vc在寒富蘋果酒產(chǎn)業(yè)上的工業(yè)化大批量應(yīng)用，同時也發(fā)現(xiàn)了其他抗氧化劑在寒富蘋果酒加工中的不同貢獻(xiàn)，在后續(xù)研究中可以考慮復(fù)合抗氧化劑的使用，全方位優(yōu)化寒富蘋果酒的品質(zhì)。