PI3K/Akt/GSK-3β通路介導(dǎo)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞多藥耐藥*

袁亞男， 嚴(yán)曉麗， 黃艷潔， 杜夢楠， 鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室， 河北 承德 067000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年升高趨勢。據(jù)2018年全球腫瘤統(tǒng)計報告顯示，結(jié)直腸癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率位列第4位，但死亡率卻高居第2位[1]。在我國，結(jié)直腸癌在男性惡性腫瘤中的發(fā)病率位列第4，在女性則位列第3位[2]。手術(shù)治療是早期結(jié)直腸癌的根治方法，而中晚期結(jié)直腸癌患者則依賴于化療、放療以提高5年生存率[3]。

目前臨床上改善結(jié)直腸癌預(yù)后的主要化療藥物以奧沙利鉑為主，但仍有半數(shù)以上的患者療效不顯著，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。克服結(jié)直腸癌的MDR，提高化療效果是目前亟待解決的問題。產(chǎn)生MDR的機(jī)制復(fù)雜多樣，其中以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活化最為主要。本課題所研究的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP-2)同屬于ABC家族，其中P-gp由ABCB1基因編碼，MRP-2由ABCC2基因編碼。目前研究發(fā)現(xiàn)，作為磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt信號通路下游靶因子的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展，是腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但在結(jié)直腸癌細(xì)胞中關(guān)于GSK-3β與多藥耐藥的關(guān)系尚未見報道。本課題通過應(yīng)用不同抑制劑改變GSK-3β的磷酸化狀態(tài)，監(jiān)測多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)變化及其對奧沙利鉑敏感性的影響，旨在探討PI3K/Akt信號通路的下游靶因子GSK-3β與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及結(jié)直腸癌多藥耐藥的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞購于廣州吉妮歐生物有限公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自上海同仁化工有限公司；PI3K/Akt信號通路抑制劑HY-13898及GSK-3β抑制劑HY-19807購自MCE；奧沙利鉑購自深圳海王藥業(yè)有限公司；總RNA抽提試劑盒和定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司；GAPDH和ABCB1、ABCC2基因上下游引物和探針購自TaKaRa；RIPA及PMSF購自Solarbio；BCA蛋白質(zhì)定量試劑購自碧云天生物科技有限公司；抗P-gp和MRP-2單克隆抗體購于Cell Signaling；抗Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9單克隆抗體購自博奧森生物有限公司。NanoDrop 2000超微量分光光度儀購自Thermo，CFX96定量PCR儀購自Bio-Rad，酶標(biāo)儀購自Thermo，化學(xué)發(fā)光儀購自Tanon。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-15用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞，分為3組:對照(control)組:HCT-15細(xì)胞+DMSO；HY-19807組:HCT-15細(xì)胞+GSK-3β抑制劑(HY-19807溶于DMSO，實(shí)驗(yàn)終濃度為 40 μmol/L，作用細(xì)胞2 h)；HY-13898 組:HCT-15細(xì)胞+PI3K/Akt信號通路抑制劑(HY-13898溶于DMSO，實(shí)驗(yàn)終濃度為 30 μmol/L，作用細(xì)胞24 h)。

2.2Western blot檢測蛋白水平 取3個實(shí)驗(yàn)組處于對數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，加入細(xì)胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶ 1)，在冰上靜置30 min。細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞并移至EP管內(nèi)，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清至另一EP管內(nèi)。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，并取各組40 μg蛋白上樣。細(xì)胞蛋白通過10% SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。在室溫下，PVDF 膜在封閉緩沖液中封閉 1～2 h，孵育 I 抗緩沖液(GSK-3β 1 ∶1 000； p-GSK3β-Ser9 1 ∶1 000； Akt 1 ∶1 000；p-Akt 1 ∶1 000； P-gp 1 ∶1 000；MRP-2 1 ∶1 000)，4 ℃過夜。次日用TBST洗膜3次,每次10 min，室溫下孵育HRP標(biāo)記的 II 抗緩沖液(1 ∶1 000)2 h，TBST洗膜3次,每次10 min。 PVDF 膜浸泡于1 ∶1比例的 ECL 發(fā)光液2～3 min，使用天能分子成像儀激發(fā)和采集目的條帶，借助ImageJ 分析軟件定量目的條帶。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞生長情況 取3個實(shí)驗(yàn)組的對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板中，并調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約6×103個。待4 h后細(xì)胞貼壁，分別加入含有不同濃度奧沙利鉑的培養(yǎng)基100 μL，每孔設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)放置在37 ℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h 后每孔內(nèi)加入含有10 μL CCK-8的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育3 h后，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測量每孔的吸光度(A)值。用細(xì)胞的存活曲線計算達(dá)到50%細(xì)胞生長抑制的奧沙利鉑的濃度，計算細(xì)胞的生長抑制率、耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。計算公式：生長抑制率(%)=(A對照組平均值-A實(shí)驗(yàn)組平均值)/(A對照組平均值-A空白對照組平均值)×100%；RI=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50/對照組細(xì)胞的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.4RT-qPCR法檢測mRNA 的表達(dá) 取3個實(shí)驗(yàn)分組中處于對數(shù)生長期的細(xì)胞加入TRIzol置冰上15 min，然后12 000×g、4 ℃離心15 min，小心取上層清液，按照RNA提取步驟依次加入1/5體積的氯仿及等體積異丙醇。將提取的RNA用Nanodrop 2000分光光度計分析測定所抽提RNA的濃度及A260/A280的數(shù)值，且A260/A280在1.8～2.1之間為純度符合要求。放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。總反應(yīng)體系20 μL，包含2×SYBR Master Mix標(biāo)準(zhǔn)混合液10 μL，上、下游引物各1 μL，標(biāo)本2 μL，去RNase水6 μL。PCR條件為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5s、60 ℃ 30s、72 ℃ 20s，共40個循環(huán)，所有標(biāo)本檢測3次。用內(nèi)參照GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果，結(jié)果采用靶基因與內(nèi)參照GAPDH濃度的比值表示。采用相對定量方法(2-ΔΔCt法)對定量結(jié)果進(jìn)行比較分析。各基因引物序列見表1。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的各基因引物序列

2.5細(xì)胞周期分布的檢測 收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定過夜，離心，PBS 洗滌，加入500 μL PI染液，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 軟件分析，計量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多個樣本均數(shù)間的比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時進(jìn)行單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示，將HY-19807作用于人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞后，p-GSK-3β-Ser9、P-gp和MRP-2的表達(dá)較未用藥的HCT-15組明顯升高(P<0.05)，GSK-3β上游的Akt及p-Akt的蛋白水平變化不明顯(P>0.05)；而將HY-13898作用于HCT-15細(xì)胞后，p-GSK3β-Ser9和p-Akt的蛋白水平降低(P<0.01)，P-gp和MRP-2蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于對照組(P<0.01)；總GSK-3β在2個實(shí)驗(yàn)組中的水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖1。提示HY19807能夠通過促進(jìn)磷酸化GSK-3β-Ser9增加HCT-15細(xì)胞ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，而HY13898可以通過抑制GSK-3β-Ser9磷酸化降低ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，且p-GSK3β-Ser9與P-gp和MRP-2的蛋白水平存在正相關(guān)。

Figure 1.The results of Western blot for determining the protein levels of total GSK-3β, p-GSK-3β-Ser9, Akt, p-Akt, MRP2 and P-gp in the HCT-15 cells after treated with different inhibitor.Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 HCT-15細(xì)胞應(yīng)用不同抑制劑后對奧沙利鉑敏感性的影響

應(yīng)用HY-19807作用于人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞后，奧沙利鉑對HCT-15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)由(19.83±0.80) mg/L升至(27.15±1.57)mg/L，耐藥指數(shù)為1.36(P<0.01)。HY-13898作用于人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞阻斷PI3K/Akt信號通路激活后，奧沙利鉑對HCT-15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)由(19.83±0.80)mg/L降至(9.93±1.77)mg/L，耐藥指數(shù)為0.5(P<0.01)，見圖2。提示HY-19807增加p-GSK-3β-Ser9的水平后可以降低HCT-15細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，而HY-13898使GSK3β-Ser9去磷酸化后可以增強(qiáng)HCT-15細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性。

Figure 2.The effect of different inhibitors on the cell viability (A) and the changes of IC50(B) in the HCT-15 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，將HY-19807作用于人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞后，ABCB1和ABCC2的mRNA表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.01)；將HY-13898作用于HCT-15細(xì)胞后，ABCB1和ABCC2的mRNA相對表達(dá)量均明顯低于對照組(P<0.05)，見圖3。提示HY-19807使GSK3β-Ser9位點(diǎn)磷酸化增加，可以促進(jìn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的表達(dá)；相反，HY-13898使GSK3β-Ser9位點(diǎn)去磷酸化后可抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的表達(dá)。

Figure 3.The relative mRNA expression of ABCC2 and ABCB1 in the HCT-15 cells after treated with different inhibitors. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.

4 細(xì)胞周期分布的變化

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，control組G1期細(xì)胞占比(59.61±0.73)%，S期細(xì)胞占比(23.38±0.74)%，HCT-15細(xì)胞經(jīng)HY-19807處理后與對照組相比G1期細(xì)胞的百分率為(45.69±0.96)%，明顯減少(P<0.01)，同時S期細(xì)胞的百分率為(39.77±0.92)%，顯著增加(P<0.01)，表明HY-19807可促使 HCT-15 細(xì)胞由G1期向S期過渡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。用HY-13898處理HCT-15細(xì)胞后，G1期的細(xì)胞百分率為(84.17±1.35)%，明顯增加(P<0.01)，同時S期的細(xì)胞百分率為(6.90±0.59)%，顯著減少(P<0.01)，表明 HY-13898可阻止HCT-15細(xì)胞由G1期向S期過渡，細(xì)胞增殖受到抑制，見圖4。

Figure 4.The effects of different inhibitors on the cell cycle distribution in the HCT-15 cells. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group.

討 論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率一直呈上升趨勢，化療是治療結(jié)直腸癌的重要輔助手段。奧沙利鉑作為臨床上廣泛應(yīng)用的鉑類化療藥，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞多藥耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響其化療效果。國內(nèi)外學(xué)者多方面研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑導(dǎo)致多藥耐藥的主要原因之一是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活化，致使藥物外排作用增加，降低細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度。本課題研究的2種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp和MRP2同屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，P-gp是由1 280個氨基酸組成的分子質(zhì)量為170 kD的單鏈跨膜糖蛋白，MRP是由1 531個氨基酸組成的分子質(zhì)量為190 kD的多藥耐藥相關(guān)蛋白，兩者能夠利用ATP水解的能量，將疏水親脂的化療藥物主動排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥。P-gp可以直接將藥物由細(xì)胞內(nèi)排出，使得細(xì)胞免受化療藥物的毒性作用。而MRP需要谷胱甘肽與藥物的共價結(jié)合來確保轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)現(xiàn)[4-5]。越來越多的證據(jù)表明這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(P-gp和MRP2)的活化是由于PI3K/Akt通路的激活所致[6-7]。

PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路是一條酪氨酸激酶級聯(lián)信號傳導(dǎo)通路，是細(xì)胞生存通路之一。PI3K/Akt通路激活使Akt發(fā)生磷酸化而激活，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase-9、NF-κB、GSK-3β、FKHR、mTOR、FKHR和p27 Kip1等。PI3K/Akt信號通路活化后不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲，Ma等[8]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路在介導(dǎo)人白血病多藥耐藥方面發(fā)揮重要作用。眾多學(xué)者在胃癌[9]、肺癌[10]、人乳腺癌[11]和肝癌[12]等多種腫瘤細(xì)胞中證實(shí)PI3K/Akt通路能夠調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，但具體機(jī)制尚不清楚。Sui等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制PI3K/Akt通路下游NF-κB磷酸化能夠下調(diào)P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌多藥耐藥。

GSK-3β是PI3K/Akt通路下游靶因子之一，PI3K/Akt通路激活后可使GSK-3β絲氨酸9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而抑制GSK-3β的活性。GSK-3β作為PI3K/Akt通路下游的靶因子，在人類多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，在前列腺癌[13]及胰腺癌[14]中GSK-3β能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。與此同時，在膽管癌細(xì)胞[15]和乳腺癌[16]中，GSK-3β激活后能夠降低ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥。通過前人的研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路的激活能夠?qū)е露嗨幠退幍陌l(fā)生，且GSK-3β與腫瘤細(xì)胞增殖與耐藥之間存在密切關(guān)系，但在直結(jié)腸癌中，PI3K/Akt通路是否通過下游靶因子GSK-3β途徑調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來參與多藥耐藥在大腸癌細(xì)胞中的作用未見報道。

本課題研究結(jié)果顯示，應(yīng)用GSK-3β抑制劑HY-19807后，奧沙利鉑對HCT-15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)由(19.83±0.80)mg/L升至(27.15±1.57)mg/L。應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑HY-13898后，奧沙利鉑對HCT-15細(xì)胞的IC50由(19.83±0.80)mg/L降至(9.93±1.77)mg/L，說明抑制GSK-3β活性后能夠增加細(xì)胞的耐藥性，阻斷PI3K/Akt信號通路,增強(qiáng)GSK-3β活性后能降低細(xì)胞的耐藥性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HY-19807作用于HCT-15細(xì)胞后，p-GSK-3β-Ser9、P-gp及MRP2的表達(dá)增加，而HY-13898作用于HCT-15細(xì)胞后，Akt表達(dá)增加，p-Akt、p-GSK-3β-Ser9、P-gp及MRP2的表達(dá)降低，兩種抑制劑對總GSK-3β表達(dá)無影響。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用HY-19807后，HCT-15細(xì)胞ABCB1和ABCC2的mRNA表達(dá)增加，應(yīng)用HY-13898后，ABCB1和ABCC2的mRNA表達(dá)降低。提示HY-19807抑制GSK-3β活性后，能夠增加HCT-15細(xì)胞中P-gp、MRP2的蛋白表達(dá)及ABCB1和ABCC2的mRNA表達(dá)，導(dǎo)致藥物外排作用增加，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，減弱腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的化療敏感性。HY-13898抑制PI3K/Akt信號通路，使GSK3β去磷酸化而激活，能夠降低HCT-15細(xì)胞中p-Akt、p-GSK-3β-Ser9、P-gp及MRP2的蛋白表達(dá)，降低ABCB1和ABCC2的mRNA表達(dá)，藥物外排作用減弱，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的化療敏感性。GSK-3β作為PI3K/Akt信號通路下游的靶因子，PI3K/Akt信號通路激活后磷酸化GSK-3β-Ser9位點(diǎn)，使GSK-3β活性降低，P-gp及MRP2表達(dá)增加。抑制PI3K/Akt信號通路能夠使GSK-3β-Ser9去磷酸化，GSK-3β活性增強(qiáng)，P-gp及MRP2表達(dá)減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在HCT-15細(xì)胞中P-gp及MRP2的表達(dá)是通過PI3K/Akt信號通路下游的GSK-3β途徑調(diào)控的，直接參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的的多藥耐藥。

本課題也證實(shí)了通過改變GSK-3β-Ser9的磷酸化表達(dá)同樣能夠?qū)CT-15細(xì)胞的增殖起到調(diào)控作用。應(yīng)用GSK-3β抑制劑HY-19807使GSK3β活性受到抑制后，HCT-15細(xì)胞G1期細(xì)胞百分率明顯減少，S期細(xì)胞百分率顯著增加，表明GSK-3β抑制劑可促使 HCT-15 細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑HY-13898使GSK-3β激活后，出現(xiàn)G1期細(xì)胞百分率明顯增加，同時S期細(xì)胞百分率顯著減少，表明 PI3K/Akt通路抑制劑可以阻止HCT-15細(xì)胞由G1期轉(zhuǎn)變?yōu)镾期，細(xì)胞增殖受到抑制?？紤]PI3K/Akt通路可以通過GSK-3β途徑調(diào)控HCT-15細(xì)胞的細(xì)胞周期，影響細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響化療藥物在臨床治療中的效果。

直結(jié)腸癌的多藥耐藥機(jī)制上存在復(fù)雜性和多因素性，GSK-3β如何調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。GSK-3β作為激酶能夠磷酸化多種底物，GSK-3β是否具有直接磷酸化ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。本研究僅在細(xì)胞水平進(jìn)行研究及實(shí)驗(yàn)，且細(xì)胞系單一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的局限性，后續(xù)研究可在多種細(xì)胞系間做比較，并收集臨床標(biāo)本開展組織學(xué)實(shí)驗(yàn)，從而更全面地研究GSK-3β在大腸癌多藥耐藥中的作用。如能明確GSK-3β與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間存在直接相關(guān)性，則可將GSK-3β作為調(diào)控大腸癌細(xì)胞化療敏感性的靶基因，臨床上就可通過抑制大腸癌患者GSK-3β-Ser9位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)來提高細(xì)胞的化療敏感性。