NK細(xì)胞對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用的實驗研究

張 鵬 韓偉杰 黃德海 孫紅衛(wèi)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052 2)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗系微生物與免疫教研室，河南 新鄭 451191

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤[1-2]，膠質(zhì)瘤(三、四級別膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)具有一般惡性腫瘤的生物學(xué)特性，如浸潤性無抑制生長、血管異常增生，并因位于免疫豁免器官腦內(nèi)，具有免疫抑制等生物學(xué)特性[3-5]，這使得膠質(zhì)瘤預(yù)后差[6-9]，仍是神經(jīng)外科的難點和熱點之一。實驗證實同種異體NK細(xì)胞可有效抑制原代的鼻咽癌、胃癌、腸癌、腎癌及 卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的生長[10-13]。本文通過觀察同種異體NK細(xì)胞對移植于裸鼠體內(nèi)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(human glioma cell，HGC)的生長情況，探討在裸鼠體內(nèi)同種異體NK細(xì)胞對HGC的殺傷效果。

1 材料與方法

1．1材料磷酸鹽緩沖液(Miltenyi Biotec公司)，CD56 MicroBeads (MiltenyiBiotee公司)；淋巴細(xì)胞分離液(TBD公司)，rhIL2(上海華新公司)，NK細(xì)胞殺傷活性檢測試劑盒(Promega公司)，C6型流式細(xì)胞儀(Accuri Cytometers 公司)，HGC由課題組原代培養(yǎng)。

1．2方法

1．2．1 NK細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng)[14]：密度梯度離心法分離1例健康人外周血單個核細(xì)胞，MACS法分選NK細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞純度。NK細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL，IL-2 1000 U/mL)，以2×105/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%二氧化碳、恒溫37 ℃的培養(yǎng)箱中，以培養(yǎng)24 h后的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。

1．2．2 HGC的分離、純化及培養(yǎng)：用酶消化法[2]對病理組織進行HGC分離，所得HGC以2～6×105個細(xì)胞/mL的密度培養(yǎng)于含鏈霉素(100 μg/mL)、青霉素(100 U/mL)和10%胎牛血清的DMEM/F12，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1．2．3 動物實驗

1．2．3．1 裸鼠：BALB/c裸鼠(購自鄭州大學(xué)試驗動物中心)，4～6周齡，體質(zhì)量(20±2)g。飼養(yǎng)在恒濕(45%～60%)、恒溫(22～28)℃、空氣潔凈層流架內(nèi)，空氣過濾罩、裸鼠盒、墊料、飲水和飼料等均經(jīng)滅菌處理，并定時在無菌條件下更換。

1．2．3．2 實驗分組：隨機等數(shù)量將24只裸鼠分為四組：A組：未移植組;B組：HGC移植組；C組：HGC+人同種異體NK 細(xì)胞移植組：D組：人同種異體NK細(xì)胞移植組。

1．2．3．3 動物模型建立：用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HGC，離心，計數(shù)，配制成每1 mL含1×107個HGC無血清DMEM/F12懸液，將0.1 mL HGC(1×106個細(xì)胞)懸液注射于BALB/c裸鼠背部皮下。NK細(xì)胞配制成每1 mL含2.5×108個細(xì)胞的懸液，用微量注射器將0.2 mL NK細(xì)胞懸液(5×107個細(xì)胞)經(jīng)尾靜脈注射于C組和D組裸鼠體內(nèi)，C組二種細(xì)胞注射同一天進行。

1．2．3．4 監(jiān)測腫瘤生長情況：自移植之日起，每天定時觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長情況，待腫瘤出現(xiàn)后用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長、寬 (長與寬垂直)最大值，分別記為 a、b，計算腫瘤體積[15]。腫瘤出現(xiàn)后第3周處死裸鼠，整塊取下腫瘤，測重量，計算腫瘤生長抑制率[(腫瘤生長抑制率=(1- 治療組腫瘤重量/對照組腫瘤重量) ×100%][16]。

1．2．3．5 腫瘤標(biāo)本的處理：測量腫瘤標(biāo)本重量，福爾馬林固定，石蠟包埋后，切片，行 HE 染色，鏡下觀察腫瘤標(biāo)本病理特征。

2 結(jié)果

2．1NK細(xì)胞的純度分選后的陽性細(xì)胞的純度達91.7%。

2．2腫瘤的生長情況A組和D組無腫瘤生長，B組(移植HGC組)和C組(HGC+ NK細(xì)胞治療組)腫瘤出現(xiàn)時間分別為(9.23±1.64)d、(15.26±1.53)d，二者比較差異有顯著性(t=4.328，P=0.000)，2組均能生長出腫瘤且B組較C組成瘤時間短。

2．3人同種異體NK細(xì)胞抑制移植HGC的生長試驗結(jié)果表明：在裸鼠體內(nèi)，移植的人同種異體NK細(xì)胞能有效抑制移植的HGC生長。生長曲線顯示移植的同種異體NK細(xì)胞能明顯減緩移植的HGC在裸鼠的生長速度，治療結(jié)束后，C組腫塊較B組腫塊明顯縮小(每組2只接近腫瘤平均體積的老鼠，圖1)。

2．4裸鼠腫瘤重量及腫瘤生長抑制率腫瘤生長組包括B組和C組，腫瘤出現(xiàn)3周后，處死大鼠，完整取出腫瘤并稱重。結(jié)果顯示：B組和C組的腫瘤重量分別為(1.74±0.13)g、(1.26±0.08)g，二者比較差異有顯著性(t=14.475，P=0.000)。人同種異體NK細(xì)胞治療組腫瘤抑制率為27.59%。

2．5移植細(xì)胞生長的腫瘤病理特點腫瘤經(jīng)切片、HE染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核呈卵圓形 或不規(guī)則形，核仁較明顯，核濃染，異形性明顯，可見多核，巨核，核分裂相，均為膠質(zhì)瘤Ⅳ級。C組(HGC+人同種異體NK 細(xì)胞治療組)可見較多的壞死腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤(圖2)。

圖1 人同種異體NK細(xì)胞對移植HGC生長的影響Figure 1 Effect of human allogeneic NK cells on the growth of transplanted HGC

圖2 B組及C組移植腫瘤細(xì)胞的病理學(xué)改變(HE×100) A：HGC移植組；B：HGC+人同種異體NK細(xì)胞治療組Figure 2 Pathological changes of transplanted tumor cells in group B and group C (HE × 100) A：HGC transplantation group；B：HGC + human allogeneic NK cell treatment group

3 討論

腦膠質(zhì)瘤，來源于神經(jīng)外胚層，是神經(jīng)上皮性腫瘤，為顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，其中以星形膠質(zhì)瘤最常見，其次為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。WHO(2007)將中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ、Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤稱為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤稱為高級別膠質(zhì)瘤[17-19]。高級別膠質(zhì)瘤具有血管異常增生、浸潤性生長、手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)及免疫抑制等特性，雖經(jīng)外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療等措施的綜合處理，仍未從根本上解決其高復(fù)發(fā)率和低治愈率的難題[20-23]。

在治療腫瘤時，盡可能少損傷機體的、而又能高效殺死腫瘤細(xì)胞的方法是人們努力尋找的方向。手術(shù)和放化療是治療惡性腫瘤的重要手段，但是為了減少損傷機體組織而采取的種種努力可能增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。近年來，免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域取得了革命性進展[24-28]。腫瘤的免疫治療于2013年被Science評為年度十大科技突破之首，為惡性腫瘤治療帶來新的曙光[29-32]。

NK細(xì)胞是不同于T、B細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，構(gòu)成了機體抗腫瘤免疫的首道防線。NK細(xì)胞對自身正常細(xì)胞無抑制殺傷作用，但可選擇性地識別和殺傷低表達或缺乏自身MHC-Ⅰ類分子的細(xì)胞[33-35]。NK細(xì)胞表面的殺傷抑制受體與靶細(xì)胞表面的HLA-Ⅰ類分子的結(jié)合，可誘發(fā) NK 細(xì)胞殺傷活性的抑制[36-39]。但當(dāng)靶細(xì)胞表面 HLA-Ⅰ類分子表達缺乏時，NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性可被激活 。試驗證實殺傷抑制受體與HLA-Ⅰ類分子的錯配可誘發(fā)NK細(xì)胞有效地殺傷惡性黑色素瘤[40-42]、腎癌細(xì)胞[43-44]等變異的細(xì)胞。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)同種異體NK細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有殺傷效應(yīng)[45-47]。本試驗中，將HGC及人同種異體NK細(xì)胞移植于裸鼠體內(nèi)，治療組(C組：HGC+人同種異體 NK 細(xì)胞移植組)成瘤時間較對照組明顯延長，治療組腫瘤體積較對照組明顯減小，人同種異體NK細(xì)胞對裸鼠皮下移植瘤的抑制率為27.59%，說明移植于同一裸鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞對HGC具有抑制、殺傷作用，NK 細(xì)胞可以延緩腫瘤的生長。研究[42，48]發(fā)現(xiàn)人與鼠NKG2D 配體不同，人與鼠的NKG2D不能識別對方的配體[49]，因此，裸鼠體內(nèi)移植的HGC的生長成瘤與自身的NK細(xì)胞無關(guān)。因此對移植HGC的抑制、殺傷效應(yīng)是通過移植的NK細(xì)胞而發(fā)揮作用的。

HARADA等[50]將人NK細(xì)胞注入荷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的小鼠體內(nèi)，病理檢查發(fā)現(xiàn)移植NK細(xì)胞的浸潤到腫瘤組織內(nèi)；NK細(xì)胞治療組小鼠生存期較對照組明顯延長。本試驗中，病理檢查發(fā)現(xiàn)：HGC+人同種異體NK細(xì)胞 移植組中可觀察到壞死的腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞周圍有明顯的NK細(xì)胞浸潤，而其它組均無明顯壞死腫 瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞周圍的淋巴細(xì)胞浸潤，這說明在裸鼠體內(nèi)，移植的人NK細(xì)胞能抑制移植的HGC的生長。

本試驗表明，移植到裸鼠體內(nèi)的人同種異體NK細(xì)胞能有效抑制移植的 HGC 的生長，NK細(xì)胞能抑制、殺傷HGC，抑制膠質(zhì)瘤生長，這為膠質(zhì)瘤的治療提供了一種新的可能的方法。