芍藥醇對膿毒癥模型大鼠急性肺損傷保護作用及其機制研究

金煥治 林 岳 陳大慶

膿毒癥是一種復(fù)雜的全身炎癥反應(yīng)綜合征，由感染引發(fā)，與多器官功能障礙綜合征和危重癥患者的死亡率相關(guān)[1]。急性肺損傷是膿毒癥的常見并發(fā)癥，在危重癥患者中有很高的發(fā)病率和死亡率[2]。膿毒癥急性肺損傷的特征是肺部炎癥反應(yīng)的過度激活，肺組織細胞凋亡及氧化水平升高[3]。盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）膿毒癥模型大鼠，抗氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）顯著下降，促炎因子白細胞介素6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平升高[4]。氧化酶-1（PON1）是一種以血清為基礎(chǔ)的抗氧化劑、抗炎劑和解毒劑，與膿毒癥的預(yù)后相關(guān)[5]。芍藥醇是從傳統(tǒng)中草藥牡丹皮、白芍根和野山藥中提取的一種成分，廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等生理過程[6-7]。研究顯示，芍藥醇顯著減輕急性肺損傷炎癥細胞浸潤和肺泡壁增厚，防止肺水腫[8]。本研究制備大鼠膿毒癥模型，觀察芍藥醇對膿毒癥急性肺損傷的保護作用，并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 18 只健康雄性SD 大鼠（SPF 級）[浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物實驗條件合格證號SYXK（浙）2018-0012，實驗動物倫理批件號2018028]，體質(zhì)量為（250±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心在SPF 條件下飼養(yǎng)繁殖，動物飼養(yǎng)及實驗操作嚴格遵守實驗動物的使用和管理原則。飼養(yǎng)室溫度在20～25℃，提供12h 光照、12h 黑暗的晝夜光變化。

1.2 藥 品 芍藥醇（中國成都瑞芬思生物科技有限公司，批號552-41-0，規(guī)格：20mg）；脂多糖（上海昂一生物科技有限公司，批號L26331，規(guī)格：50mg）。

1.3 主要試劑 高遷移率族蛋白B1（HMGB1，美國CST 公司，批號6893）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase9，美國CST 公司，批號9504）、cleaved-Caspase9（美國CST 公司，批號9509）、B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因（Bcl-2，美國CST 公司，批號15071）和核轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2，美國abcam 公司，批號76062），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（美國eBioscience公司，批號88-7324-77）、IL-6 試劑盒（美國eBioscience 公司，批號88-7064-22）、TGF-β 試劑盒（美國eBioscience 公司，批號88-50690-22），丙二醛（MDA）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所，批號A003-1-2）、SOD 試劑盒（中國南京建成生物工程研究所，批號A001-3-2）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所，批號A007-1-1）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所，批號A015-1-2）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥 18 只健康雄性SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和芍藥醇組，每組6 只。模型組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖制備膿毒癥模型；芍藥醇組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖2h后，尾靜脈單次注射50mg/kg 芍藥醇（濃度設(shè)置參考文獻[8-9]）；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

2.2 大鼠肺組織氧化因子水平檢測 造模24h 后，3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠，無菌操作下打開并暴露胸腔，取肺組織，制成組織勻漿，按MDA 試劑盒操作，分光光度計記錄450nm 處吸光度，計算MDA 含量；按T-AOC 試劑盒操作，分光光度計記錄520nm 處吸光度，計算T-AOC 酶活性；按CAT 測定試劑盒操作，分光光度計記錄240nm 處吸光度，計算CAT 酶活性；按SOD 試劑盒操作，分光光度計記錄550nm 處吸光度，計算SOD 含量。

2.3 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β 炎癥因子水平檢測 造模24h 后，3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠，無菌操作下打開并暴露胸腔，取肺組織，制成組織勻漿，采用ELISA 法分別檢測各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β 炎性因子水平。

2.4 大鼠肺組織蛋白檢測 3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠，無菌操作下打開并暴露胸腔，取肺組織，提取組織蛋白，BCA 法進行蛋白定量，蛋白變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶封閉常溫孵育1h，按一抗?jié)舛菻MGB1（1：1000）、Caspase9（1：2000）、cleaved-Caspase9（1：2000）、Bcl-2（1：5000）、Nrf2（1：1000）和β-actin（1：10000），4℃孵育過夜，洗膜液洗3 次，每次10min，二抗?jié)舛龋?：10000）孵育1.5h，洗膜液洗3 次，每次10min，化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測HMGB1、Caspase9、cleaved-Caspase9、Bcl-2 和Nrf2 蛋白表達，以β-actin 為內(nèi)參。

2.5 大鼠肺組織miRNA 檢測 3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠，無菌操作下打開并暴露胸腔，取肺組織，Trizol 法提取組織總RNA，將提取的RNA 進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄的cDNA 作為模板加入合成的引物，進行PCR 檢測，PCR 程序如下：37℃，15min；95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40 個循環(huán)。為了計算每個目標(biāo)基因的表達水平的差異，以U6 表達量為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt 計算miRNA 相對表達水平。miRNA引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成，具體序列如下：miR-21-F：5'-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3'，miR-21-R：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；miR-126-F：5'-TATTTTGAAGAGGTTTTTGGAAGG-3'，miR-126-R：5'-CCAAAACACACAACTAACTAAAAACAA-3'；miR-223-F：5'-ATGGTTCGTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3'；miR-223-R：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC -3'；U6 -F：5' -CGCTTCGGCAGCCACATATACTA-3'，U6-R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織MDA、T-AOC、CAT、SOD 水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平顯著升高，表現(xiàn)為MDA 水平顯著提高，T-AOC水平顯著下降，CAT 和SOD 活性減低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，芍藥醇組大鼠肺組織T-AOC 水平升高，MDA 水平降低，CAT 和SOD 活性增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠肺組織MDA、T-AOC、CAT、SOD 水平比較（）

表1 各組大鼠肺組織MDA、T-AOC、CAT、SOD 水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；T-AOC：總抗氧化能力；MDA：丙二醛；CAT：過氧化氫酶；SOD：超氧化物歧化酶；模型組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖；芍藥醇組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖+尾靜脈單次注射50mg/kg 芍藥醇；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水

3.2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β 水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織炎癥反應(yīng)增強，表現(xiàn)為TNF-α、IL-6、TGF-β 濃度升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，芍藥醇組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β 濃度降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

3.3 各組膿毒癥急性肺損傷大鼠凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)蛋白表達量比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及氧化應(yīng)激通路激活，表現(xiàn)為Bcl-2 表達減少，Caspase9 蛋白發(fā)生剪切，cleaved-Caspase9 表達增加，炎癥通路關(guān)鍵蛋白HMGB1 表達增加，Nrf2 表達減少。與模型組比較，芍藥醇組大鼠肺組織Bcl-2 和Nrf2 蛋白表達增多，Caspase9蛋白發(fā)生剪切，cleaved -Caspase9 和HMGB1 蛋白表達減少。見圖1。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β 水平比較（）

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β 水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素6；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長因子-β；模型組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖；芍藥醇組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖+尾靜脈單次注射50mg/kg 芍藥醇；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水

圖1 芍藥醇調(diào)控凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)通路蛋白表達

3.4 各組膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織miRNA 水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織miR-126、miR-223 水平降低，miR-21 水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組比較，芍藥醇組大鼠肺組織miR-126、miR-223 水平升高，miR-21 水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織miR-126、miR-223 及miR-21 水平比較（）

表3 各組大鼠肺組織miR-126、miR-223 及miR-21 水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；miR-126：非編碼單鏈小RNA 分子126；miR-223：非編碼單鏈小RNA 分子223；miR-21 非編碼單鏈小RNA 分子21；模型組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖；芍藥醇組大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖+尾靜脈單次注射50mg/kg 芍藥醇；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水

4 討論

膿毒癥死亡率和發(fā)病率的主要原因是由急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）引起的急性肺損傷。ARDS 主要由細胞促炎因子的釋放、聚集的粒細胞和單核細胞進入肺，導(dǎo)致肺血管通透性增加，肺泡通氣喪失引起[9]。除保護性機械通氣外，目前尚無針對急性肺損傷的特異性、有效藥物干預(yù)措施。

研究報道，氨基噻唑-芍藥醇衍生物（APDs）作為一種強效抗炎劑，發(fā)揮抗炎作用，顯著改善急性肺損傷和ARDs[10]。芍藥醇抗炎和抗氧化功效已在牙周炎和皮炎等炎性疾病中被證實[11-12]。芍藥醇通過調(diào)控Nrf2/核因子-κB（NF-κB）通路顯著抑制牙周炎炎癥反應(yīng)和氧化水平[13]。含有芍藥醇的潤膚劑能顯著改善小鼠特應(yīng)性皮炎模型的皮膚含水量、pH 值和水分流失率，且無皮膚刺激[14]?；谏炙幋嫉墓πВ狙芯堪l(fā)現(xiàn)，芍藥醇顯著抑制膿毒癥急性肺損傷炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡，Western blot 結(jié)果表明，芍藥醇可能通過HMGB1 調(diào)控炎癥反應(yīng)，Nrf2 調(diào)控氧化應(yīng)激，Bcl-2 抑制細胞凋亡，但具體機制還需進一步探索。

miRNA 作為機體中廣泛存在的非編碼RNA，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、預(yù)后及治療策略。在一項實驗性研究中，187 例膿毒癥患者血漿miR-223 水平降低，且與疾病嚴重程度和炎癥標(biāo)志物水平相關(guān)，可能成為膿毒癥患者新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[15]。芍藥醇通過刺激單核細胞來源的外泌體miRNA-223 來減輕內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，芍藥醇可顯著升高肺組織miR-223 水平。敲除小鼠腎小管上皮細胞miRNA-21 可增加NF-κB 活性，降低Bcl-2 表達，加重膿毒癥缺血引起的器官損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，芍藥醇顯著降低肺組織miR-21 水平，伴隨Bcl-2 表達增加。升高miR-126 水平顯著提高膿毒癥大鼠的存活率[18]。miR-126 靶向抑制胰島素受體底物1（IRS1）轉(zhuǎn)錄水平，促進參與糖異生和氧化應(yīng)激抵抗的基因表達[19]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥醇提高miR-126 水平，增加抗氧化蛋白Nrf2 表達，改變氧化因子水平。但芍藥醇通過調(diào)控膿毒癥miRNA 水平影響肺損傷的機制還需進一步研究。因此，芍藥醇抑制膿毒癥急性肺損傷炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡，主要表現(xiàn)為氧化因子、炎性因子及相關(guān)蛋白和miRNA 改變，為芍藥醇臨床上治療膿毒癥提供理論依據(jù)。