鐵代謝相關(guān)蛋白在燒傷后增生性瘢痕中的表達(dá)

李冬軍 趙連魁 李明 楊建民

[摘要]目的：探討燒傷后增生性瘢痕患者中鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。方法：組織標(biāo)本均來自2016年-2018年石家莊市第一醫(yī)院燒傷整形外科住院患者?；颊叻秩M：正常皮膚組、萎縮性瘢痕組、增生性瘢痕組。后兩組患者分別采集瘢痕及其自身正常皮膚標(biāo)本。術(shù)中采集標(biāo)本，應(yīng)用電感耦合質(zhì)譜分析儀測定三組標(biāo)本中組織鐵含量。免疫組織化學(xué)染色檢測增生性瘢痕中鐵代謝相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 （transferrin receptor 1，TfR1）、鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)TL）、二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ferroportin 1，F(xiàn)PN1）等在增生性瘢痕中的表達(dá)。結(jié)果：三組正常皮膚組織中組織鐵含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。增生性瘢痕組：增生性瘢痕組織比自身正常皮膚組織中組織鐵含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化顯示增生性瘢痕組中增生性瘢痕組織及自身正常皮膚組織中均有鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，多表達(dá)于胞漿中，在表皮層表達(dá)較強(qiáng)。其中DMT1（±IRE）、FPN1以及FTL在增生性瘢痕組織中表達(dá)量高于其自身正常皮膚組織（P<0.05）;TfR1在增生性瘢痕組織中表達(dá)量卻降低（P<0.05）。結(jié)論：增生性瘢痕組患者瘢痕局部鐵元素沉積過多，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)可能通過IRP/IRE系統(tǒng)調(diào)節(jié)鐵的攝取和釋放，而且推測主要依賴于TfR1以及FPN1的作用而非DMT1（±IRE）。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕;萎縮性瘢痕;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1;鐵蛋白;二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1;膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）12-0079-04

Expression of Iron Metabolism Related Proteins in Hypertrophic Scars after Burn

LI Dong-jun1，ZHAO Lian-kui1，LI Ming1，YANG Jian-min2

（1.Department of Burn and Plastic Surgery，the First Hospital of Shjiazhuang，Shijiazhuang 050011，Hebei，China;2.Department of Plastic Surgery，Tsinghua Changgeng Hospital，Beijing 102218，China）

Abstract： Objective ?To study the expression of iron metabolism related proteins in hypertrophic scars of burn patients. Methods ?Tissue specimens were collected from inpatients in burn and plastic surgery department of Shijiazhuang First Hospital from 2016 to 2018. The patients were divided into three groups： the normal skin group， the atrophic scar group and the hypertrophic scar group. In the latter two groups， scars and normal skin specimens were collected. Specimens were collected during the operation. Tissue iron content in three groups of specimens was determined by inductively coupled mass spectrum analyzer. Immunohistochemical staining was used to detect the expression and localization of the iron metabolism related protein oftransferrin receptor 1 （TfR1）， ferritin （FTL）， divalent metal transporter 1 （DMT1） and membrane iron transporter 1 （FPN1） in hypertrophic scars and its own normal skin specimens of the hypertrophic scar group. Results ?There was no significant difference in iron content in normal skin tissue between the three groups （P>0.05）. The iron content in hypertrophic scar tissue in the hypertrophic scar group was higher than that in normal skin tissue （P<0.05）. Immunohistochemistry showed that iron metabolism related proteins were expressed in hypertrophic scar tissue and normal skin tissue of the hypertrophic scar group. Most of them were expressed in the cytoplasm. The expression was strong in the epidermis. The expression of DMT1 （±IRE）， FPN1 and FTL in hypertrophic scar tissue was higher than that in normal skin tissue （P<0.05）. The expression of TfR1 in hypertrophic scar tissue was decreased （P<0.05）. Conclusion ?In hypertrophic scar patients， excessive iron deposition in scar area may lead to intracellular regulation of iron uptake and release through IRP/IRE system， and it is presumed that the role of TfR1 and FPN1 rather than DMT1 （±IRE） is mainly dependent on the role of TfR1 and FPN1.

Key words： hypertrophic scar; atrophic scar; transferrin receptor 1; ferritin; divalent metal transporter protein 1; ferroportin 1

增生性瘢痕是由創(chuàng)傷、手術(shù)等引起，是以成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的病理性瘢痕。臨床上增生性瘢痕是嚴(yán)重?zé)?、?chuàng)傷患者后期恢復(fù)所要面臨的主要問題[1]。增生性瘢痕的預(yù)防和治療是燒傷整形領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。已有學(xué)者證實微量元素不僅影響機(jī)體生長發(fā)育還可對組織增生修復(fù)產(chǎn)生一定作用，如Muri[2]在對瘢痕的研究中提出，病理性瘢痕的發(fā)生可能與瘢痕中缺乏某種物質(zhì)有關(guān);秦澤蓮等[3]發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕組織中微量元素含量較自身正常皮膚減少，認(rèn)為微量元素的減少可能與增生性瘢痕的形成有關(guān)。但直到目前為止，其具體的發(fā)生機(jī)制仍不明確。本研究通過檢測燒傷患者增生性瘢痕中的鐵元素含量及鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)狀況，分析鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的變化特點(diǎn)與增生性瘢痕形成的關(guān)系，旨在為臨床治療燒傷增生性瘢痕提供新的思路。

1 ?材料和方法

1.1 病例資料：組織標(biāo)本均來自2016年-2018年石家莊市第一醫(yī)院燒傷整形外科住院患者?；颊叻?組：正常皮膚組（A組）：取自外傷及美容手術(shù)受術(shù)者，取其正常皮膚標(biāo)本，共15例;萎縮性瘢痕組（B組）：選取無任何癥狀，因單純美容需求行瘢痕切除術(shù)的患者15例;增生性瘢痕組（C組）：選取具有增生性瘢痕典型癥狀體征的患者15例?；颊呔鶡o職業(yè)性金屬元素接觸史和家族性瘢痕增生史;瘢痕患者術(shù)前未曾采用任何防治瘢痕的藥物及相關(guān)治療;患者均簽署知情同意書。術(shù)前采血，術(shù)中采集標(biāo)本。

1.2 主要試劑：兔抗大鼠多克隆FPN1一抗、鼠抗人單克隆TfR1一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1+IRE一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1-IRE一抗、兔抗人多克隆β-actin一抗均為Alpha Diagnostic International，USA產(chǎn)品;HRP-藕聯(lián)的山羊抗小鼠IgG單抗、HRP-藕聯(lián)的山羊抗兔IgG單抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)本采集及留存：萎縮性瘢痕組及增生性瘢痕組患者分別采集瘢痕及其自身正常皮膚標(biāo)本，瘢痕分別取材于面頸部、肩背部、腋窩部及上肢;正常皮膚取自同一患者全厚皮片移植剩余部分，取材于上肢、腹部及下肢。每例標(biāo)本取材后均立即分為兩份，一份置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片;另一份立即放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織鐵測定：皮膚和瘢痕組織充分解凍后用雙蒸去離子水沖洗6次，自然干燥24h后稱重。分別取樣0.3g置于消化器中，加入純硝酸2ml，70℃水浴中加熱4h，待樣品溶解后繼續(xù)100℃水浴加熱2～3h，使消化器中溶液體積保持0.5ml;加入高氯酸0.1ml，并置于70℃水浴中加熱1～2h至溶液呈清亮;將溶液轉(zhuǎn)移入定容管內(nèi)，用雙蒸去離子水分別定容5ml。應(yīng)用電感耦合質(zhì)譜分析儀測定定容液中Fe元素的含量。按以下公式計算樣品中Fe含量（μg/g）：定溶液微量元素含量（μg/g）×定容液體積（5ml）/樣品重量（g）[4]。

1.5 免疫組織化學(xué)染色：免疫組化按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。TfR1鼠抗人單克隆抗體稀釋度為1：100，DMT1+IRE、FPN1、FTL兔抗人多克隆抗體稀釋度為1：200。PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷陽性表達(dá)在細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。染色強(qiáng)度半定量分析：0（無表達(dá)），1（弱表達(dá)，染色較淺），2（染色中等程度），3（染色較深）。免疫組化染色強(qiáng)度評估由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立完成。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：采用Graphpad 5.0統(tǒng)計學(xué)處理軟件進(jìn)行分析，采用配對檢驗方法及非參數(shù)單因素AVONA分析，實驗結(jié)果用（x?±s）表示。

2 ?結(jié)果

2.1 組織鐵含量：正常皮膚組、萎縮性瘢痕組、增生性瘢痕組正常皮膚中組織鐵含量（μg/g）分別為：49.65±6.12，48.36±2.94，47.92±4.21，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。萎縮性瘢痕組：萎縮性瘢痕與其自身正常皮膚中組織鐵含量（μg/g）為：45.37±4.15，48.36±2.94，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。增生性瘢痕組：增生性瘢痕與其自身正常皮膚中組織鐵含量（μg/g）為：69.71±4.53，47.92±4.21，二者比較，瘢痕組織鐵含量增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 免疫組化檢測增生性瘢痕組織中鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化：在所有病例中增生性瘢痕組織較其正常皮膚組織中FTL、DMT1+IRE、DMT1-IRE、FPN1表達(dá)顯著增高。增生性瘢痕及正常皮膚組織中表達(dá)較廣泛，在表皮層表達(dá)相對較強(qiáng)，在真皮及皮下組織中表達(dá)較弱。FTL主要表達(dá)在胞漿中。DMT1+IRE、DMT1-IRE及FPN1主要表達(dá)在胞漿、胞膜中，胞核內(nèi)表達(dá)相對較弱。而在所有病例中增生性瘢痕組織較其正常皮膚組織中TfR1表達(dá)顯著降低。增生性瘢痕及正常皮膚組織的表皮層表達(dá)相對較強(qiáng)，真皮及皮下組織中表達(dá)相對較弱。TfR1在細(xì)胞中主要表達(dá)在胞漿中。

3 ?討論

研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重創(chuàng)傷尤其是中、重度燒傷后的早期，患者體內(nèi)的微量元素含量往往有較大異常。另有研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕組織中的鈣、鎂、鋅、鐵和銅含量較其自身正常皮膚的含量下降。其中鐵是人體的必需微量元素，參與體內(nèi)眾多的生化反應(yīng)，鐵代謝紊亂可引起多種常見疾病[5-7]。鐵作為維持機(jī)體生命活動和組織細(xì)胞新陳代謝的重要物質(zhì)，直接或間接參與到創(chuàng)傷修復(fù)過程中的細(xì)胞免疫、傷口愈合及抗氧化反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)[8-9]，過多或不足都將會影響創(chuàng)面的愈合[10]。目前，已有的研究都集中于增生性瘢痕中各種微量元素較正常皮膚中的含量的變化的研究，而有關(guān)增生性瘢痕中鐵代謝相關(guān)基因蛋白表達(dá)的變化鮮有研究，本實驗就增生性瘢痕和鐵代謝相關(guān)蛋白之間的聯(lián)系作一探討。

已知，細(xì)胞內(nèi)鐵水平能夠直接通過鐵調(diào)節(jié)蛋白 （iron regulatory protein，IRP）、鐵反應(yīng)元件 （iron resposive element，IRE） 調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)[11]。鐵代謝相關(guān)蛋白有：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 （TfR1）、鐵蛋白（Fn）、二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FPN1）等。正常生理情況下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵含量較高時，胞內(nèi)鐵可與IRP結(jié)合，從而抑制IRP與IRE結(jié)合的活性，這樣IRP不能與DMT1和TfR1 3'端的IRE結(jié)合，失去對DMT1和TfR1 mRNA的保護(hù)作用，其mRNA被降解，阻止二者的轉(zhuǎn)錄，DMT1、TfR1蛋白表達(dá)水平下降，細(xì)胞從胞外攝入鐵的能力隨之下降;此時FPN1 5'IRE也不能與IRP結(jié)合，F(xiàn)PN1的翻譯抑制被解除，F(xiàn)PN1大量表達(dá)，增加鐵從細(xì)胞內(nèi)向外的輸出[4]。反之，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵水平較低時，與IRP結(jié)合的鐵和IRP分離，激活I(lǐng)RP與IRE結(jié)合活性，IRP即與DMT1和TfR1 3'端的IRE結(jié)合，保護(hù)DMT1和TfR1 mRNA，使其免被降解，DMT1、TfR1蛋白水平表達(dá)上升，從而增加細(xì)胞鐵攝取，此時FPN1 5'IRE與IRP結(jié)合，抑制FPN1的翻譯，F(xiàn)PN1表達(dá)隨之下降，減少鐵向細(xì)胞外的輸出。鐵代謝相關(guān)蛋白通過上述原理達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵水平的作用[12]。

本實驗結(jié)果顯示增生性瘢痕組患者瘢痕局部組織鐵含量升高明顯，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)鐵蛋白FTL的表達(dá)量也上升，這二者都提示瘢痕局部鐵元素可能沉積過多。在瘢痕異常增生情況下，成纖維細(xì)胞、膠原細(xì)胞等細(xì)胞通過IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)攝入了大量的鐵，來滿足瘢痕內(nèi)各種細(xì)胞的生長增殖及抗氧化的需要;然而攝入的鐵過多，使胞內(nèi)鐵過載，在IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用下，TfR1、DMT1（±IRE）表達(dá)量下降，從而減少細(xì)胞鐵攝入;FPN1表達(dá)升高，進(jìn)一步增加鐵釋放，以維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。但實驗中發(fā)現(xiàn)TfR1表達(dá)量下降，而DMT1（±IRE）表達(dá)卻增高，F(xiàn)PN1表達(dá)升高，分析其原因可能是TfR1在皮膚組織中本底表達(dá)低[13]，TfR1由于細(xì)胞內(nèi)鐵的增加而表達(dá)進(jìn)一步下降。另一方面，這還可能因增生性瘢痕中其他的二價金屬離子Zn、Cu等的含量較低[2]，而DMT1（±IRE） 是細(xì)胞中主要的二價金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體，對這些微量元素亦有攝取作用，為維持這些元素的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞會通過增加DMT1（±IRE）的表達(dá)盡量攝取所需要的Zn、Cu等。因此推測在皮膚組織中，通過胞內(nèi)的IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)，鐵的攝取釋放在主要依賴于TfR1以及FPN1的作用而非DMT1（±IRE）。除此之外，也可能還有其他的未知調(diào)節(jié)因素在鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)過程中起作用，且作用大于IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

綜上所述，本研究通過免疫組織化學(xué)的方法研究了鐵代謝相關(guān)蛋白TfR1、DMT1（±IRE）、FPN1以及FTL在燒傷后增生性瘢痕組織及正常皮膚組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，DMT1（±IRE）、FPN1及FTL在增生性瘢痕組織中高表達(dá)，TfR1表達(dá)量卻下降。通過本研究，初步證實鐵代謝相關(guān)蛋白各自在增生性瘢痕組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平理解認(rèn)識增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展提供了新方向，將為增生性瘢痕的治療提供新的途徑、新的靶點(diǎn)的理論依據(jù)。本研究僅初步探討了鐵代謝相關(guān)蛋白在增生性瘢痕組織中的表達(dá)情況，樣本量較少，仍需增加樣本量對上述結(jié)論進(jìn)行驗證。

[參考文獻(xiàn)]

[1]蔡景龍.現(xiàn)代瘢痕學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：103-104.

[2]Muri IF.On the nature of keloid and hypcrtrophic scars[J].J Br Plast

Surg，1990，43（1）：61-69.

[3]秦澤蓮，繆亦，牛星熹.增生性瘢痕的金屬元素含量變化[J].中華整形外科雜志，2001，17（2）：93-95.

[4]Ding H，Yan CZ，Shi H，et al.Hepcidin is involved in iron regulation in the ischemic brain[J].PLoS One，2011，6（9）：e25324.

[5]Naomichi Abe，Takuma Tsuchida，Shin-Ichiro Yasuda，et al.Dietary iron restriction leads to a reduction in hepatic fibrosis in a rat model of non-alcoholic steatohepatitis[J].Biol Open，2019，8（5）.pii：bio040519.

[6]Ke Y，Qian ZM.Brain iron metabolism： neurobiology and rochemistry[J].Prog Neurobiol，2007，83（3）：149-173.

[7]Dev S，Babitt JL.Overview of iron metabolism in health and disease[J].Hemodial Int，2017，21（Suppl 1）：S6-S20.

[8]Dixon SJ，Stockwell BR.The role of iron and reactive oxygen species in cell death[J].Nat Chem Biol，2014，10（1）：9-17.

[9]Berger MM.Antioxidant micronutrients in major trauma and burns： evidence and practice[J].Nutr Clin Pract，2006，21（5）：438-449.

[10]Lynam EC，Xie Y，Dawson R，et al.Severe hypoxia and malnutrition collectively contribute to scar fibroblast inhibition and cell apoptosis[J].Wound Repair Regen，2015，23（5）：664-671.

[11]Pantopoulos K.Iron metabolism and the IRE/IRP regulatory system： an update[J].Ann N Y Acad Sci，2004，1012：1-13.

[12]Anderson GJ，F(xiàn)razer DM.Current understanding of iron homeostasis[J].Am J Clin Nutr，2017，106（Suppl 6）：1559S-1566S.

[13]Berger MM，Shenkin A.Trace element requirements in critically ill burned patients[J].J Trace Elem Med Biol，2007，21（Suppl 1）：44-48.

[收稿日期]2019-04-27

本文引用格式：李冬軍，趙連魁，李明，等.鐵代謝相關(guān)蛋白在燒傷后增生性瘢痕中的表達(dá)[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（12）：79-82.