水稻糖代謝相關(guān)酶和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的鑒定和表達(dá)分析

王義杰　張紹杰　賴艷　胡永峰

摘要：水稻（Oryza sativa L.）子粒淀粉的積累是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，灌漿期葉片通過光合作用合成蔗糖，并運(yùn)輸?shù)阶恿榈矸酆铣商峁┰?，該過程中所涉及的代謝相關(guān)酶和運(yùn)輸相關(guān)蛋白已有研究報道。對卡爾文循環(huán)、蔗糖合成與降解、淀粉合成與降解等糖代謝相關(guān)的酶以及糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)糖代謝相關(guān)蛋白編碼基因148個和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因102個，其中有228個基因已有文獻(xiàn)報道，新鑒定基因22個。表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)其中的部分基因表達(dá)具有組織特異性，與其功能有密切的關(guān)系。同時還發(fā)現(xiàn)許多基因受逆境脅迫影響表達(dá)發(fā)生變化，表明這些基因可能在水稻抗逆境脅迫中具有重要的作用。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;糖代謝;糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;產(chǎn)量形成

中圖分類號：S511;Q78? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）22-0185-09

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.043? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Identification and expression analysis of genes encoding carbohydrate metabolism enzymes and sugar transporters

WANG Yi-jie，ZHANG Shao-jie，LAI Yan，HU Yong-feng

（Jingchu University of Technology/Institute of Plant Germplasm Resources Exploitation and Utilization，Jingmen 448000，Hubei，China）

Abstract： Starch accumulation in rice（Oryza sativa L.） seeds is the basis of rice yield formation. In filling stage sucrose is synthesized in rice leaves by photosynthesis， and then transported to seeds providing materials for starch synthesis. Several enzymes and transporters in this process have been reported. In this paper the genes encoding enzymes involved in carbohydrate metabolism including Calvin cycle， sucrose synthesis and degradation， starch synthesis and degradation and genes encoding sugar transporters were analyzed systematically. 148 genes encoding carbohydrate metabolism enzymes and 102 genes encoding sugar transporters were identified. 228 of these genes have been reported previously and 22 genes were found for the first time. Expression profile analysis indicates that some genes showed tissue specific expression pattern， which is closely related to their function. Expression of many genes was affected by abiotic stresses， demonstrating the important role of these genes in resistance to stress.

Key words： rice（Oryza sativa L.）; carbohydrate metabolism; sugar transporter; yield formation

水稻（Oryza sativa L.）是中國主要的糧食作物之一，提高水稻產(chǎn)量是育種學(xué)家主要的育種目標(biāo)，水稻子粒淀粉的積累是水稻的產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，子粒淀粉合成的原料來源于葉片光合作用的產(chǎn)物，將葉片等可輸出光合產(chǎn)物的器官稱為“源”器官，而子粒等消耗或者儲藏光合產(chǎn)物的器官稱為“庫”器官，連接源庫器官的系統(tǒng)稱為“流”，源流庫協(xié)同作用是提高水稻產(chǎn)量的重要生理基礎(chǔ)[1]。

植物體內(nèi)光合產(chǎn)物的形成、運(yùn)輸以及在子粒中淀粉合成的過程已有一定的研究基礎(chǔ)。通過光合作用的卡爾文循環(huán)在葉片葉綠體中形成磷酸丙糖，磷酸丙糖被運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中用于合成蔗糖[2]。在雙子葉植物中磷酸丙糖可在葉綠體中暫時合成淀粉[3]，但在水稻中淀粉的暫時儲存是發(fā)生在葉鞘和莖中，在抽穗之前蔗糖被運(yùn)輸至葉鞘和莖中用于暫時合成淀粉，抽穗之后淀粉分解用于合成蔗糖，然后運(yùn)輸至子粒合成淀粉[4]。蔗糖是植物運(yùn)輸光合產(chǎn)物的主要形式，葉肉細(xì)胞產(chǎn)生的蔗糖通過共質(zhì)體和質(zhì)外體兩種途徑短距離運(yùn)輸?shù)皆炊隧g皮部，裝載到篩管-伴胞復(fù)合體中，然后在篩管中進(jìn)行長距離運(yùn)輸，在庫端韌皮部卸載，并通過共質(zhì)體和質(zhì)外體兩種途徑進(jìn)入庫器官[1]。蔗糖可通過蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)分解，也可在細(xì)胞外分解為單糖后由單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，單糖最終被運(yùn)輸至子粒的質(zhì)體中用于淀粉的合成[2]（圖1）。

部分參與糖代謝的酶和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因已相繼被鑒定出來。其中，參與卡爾文循環(huán)的編碼基因有：5個編碼Rubisco小亞基的RBCS基因（OsRBCS1-5）[5]，4個編碼磷酸甘油酸激酶（PGK）的編碼基因（Ospgk1-4）[5]，7個3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）編碼基因，包括OsGAPC1-3、OsGAPCp1、OsGAPCp2以及OsGAPA和OsGAPB，分別定位在細(xì)胞質(zhì)、非綠色質(zhì)體和葉綠體中[6]，3個丙糖磷酸異構(gòu)酶（TPI）編碼基因（OscTPI1、OscTPI2和OspTPI）[5]，3個1，6-二磷酸果糖酯酶（FBPase）編碼基因[5]，1個1，7-二磷酸景天庚酮糖酯酶（SBPase）編碼基因（OsSBP）[7]，2個磷酸戊糖異構(gòu)酶（RPE）編碼基因（OsRPEcyt和OsRPEchl）[8]，1個5-磷酸核酮糖在磷酸核酮糖激酶（PRK）編碼基因[9]。參與蔗糖合成與降解的編碼基因有：2個6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI）編碼基因[10]，2個葡萄糖磷酸變位酶（PGM）編碼基因（OscPGM和OspPGM）[5]，2個UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）編碼基因（OsUGP1和OsUGP2）[5]，5個磷酸蔗糖合酶（SPS）編碼基因（OsSPS1、OsSPS2、OsSPS6、OsSPS8和OsSPS11）[5]，3個磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）編碼基因（OsSPP1、OsSPP2和OsSPP3）[11]，7個蔗糖合酶（SUS）編碼基因（OsSUS1～OsSUS7）[5]，9個細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（OsCIN1～OsCIN9）、2個液泡轉(zhuǎn)化酶（OsVIN1和OsVIN2）和8個堿性轉(zhuǎn)化酶（OsNIN1～OsNIN8）[12]。參與淀粉合成編碼基因有：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基由4個基因編碼（OsAGPL1-4），小亞基由2個基因編碼（OsAGPS1～OsAGPS2），淀粉合酶由7個OsSS和2個OsGBSS基因編碼，淀粉分支酶由3個基因編碼，淀粉去分支酶由4個基因編碼，淀粉歧化酶由2個基因編碼[13]。淀粉的降解主要依賴葡聚糖-水雙激酶（GWD）、磷酸葡聚糖-水雙激酶（PWD）、磷酸葡聚糖磷酸酶（SEX4）α淀粉酶（Amy）、β淀粉酶（BAM），在水稻中OsGWD1、OsPWD和OsSEX4已被鑒定出來[5]，α淀粉酶由11個基因編碼[14]，有7個基因編碼β淀粉酶[15]。另外，在淀粉和蔗糖的合成過程中也具有非常重要作用的己糖激酶（HXK）和果糖激酶（FK）編碼基因也已經(jīng)被鑒定出來，水稻中的己糖激酶由10個基因編碼（OsHXK1～OsHXK10）[5]，有2個果糖激酶編碼基因（OsFKI和OsFKII）[16]。

糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已鑒定的基因有：2個磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TPT）編碼基因（OsTPT1和OsTPT2）[5]，4個磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GPT）編碼基因（OsGPT1、OsGPT2-1、OsGPT2-2和OsGPT2-3）[17]，3個ADP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因（OsBT1-1、OsBT1-2和OsBT1-3）[18]，但只有OsBT1-1具有轉(zhuǎn)運(yùn)ADP-葡萄糖的活性，而其他兩個蛋白只能轉(zhuǎn)運(yùn)AMP、ADP和ATP，而不具備轉(zhuǎn)運(yùn)ADP-葡萄糖的活性。功能分析表明，OsBT1-1參與淀粉的合成，而OsBT1-3與葉片中葉綠體的發(fā)育有關(guān)[5]。5個蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因：OsSUT1～OsSUT5[5]，21個SWEET蛋白編碼基因[19]，1個麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因（OsMEX1）[20]。但仍有部分參與糖代謝的酶和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因沒有鑒定，本研究對水稻源流庫器官中糖類的合成與降解相關(guān)的酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因進(jìn)行鑒定，包含卡爾文循環(huán)、淀粉合成與降解、蔗糖合成與降解、己糖激酶和果糖激酶以及糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，并對這些基因的表達(dá)譜以及響應(yīng)非生物脅迫表達(dá)變化進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步弄清楚水稻子粒淀粉積累的分子機(jī)制、提高水稻產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 水稻糖代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的鑒定

用小麥（Triticum aestivum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）或水稻中已報道的蛋白序列作為query分別在RGAP數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）、RAPDB數(shù)據(jù)庫（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）和NCBI數(shù)據(jù)庫中（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行搜索，進(jìn)行序列比對，并將序列在SMART數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）中進(jìn)行預(yù)測，確定蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.2? 進(jìn)化樹分析

將要進(jìn)行進(jìn)化樹分析的蛋白質(zhì)序列用ClustalX 程序進(jìn)行序列比對，然后用MEGA 3.1軟件鄰近連接法（Neighborhood-joining）進(jìn)行進(jìn)化樹分析，使用如下參數(shù)：Model：Amino：Poisson correction，Gaps/Missing Data：Pairwise Deletion，phylogeny Test and options：Bootstrap，Replications：1000，Random seed，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.3? 表達(dá)分析

在RiceChip注釋網(wǎng)站上（http：//www.ricechip.org/）獲取每個基因的AFFY Probe Set IDs，基因表達(dá)譜分析用基因的AFFY Probe Set IDs作為query在CREP數(shù)據(jù)庫（http：//crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl）中搜索[5]，獲取的基因表達(dá)值用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析，并用Treeview軟件進(jìn)行可視化。從GEO數(shù)據(jù)庫中下載芯片數(shù)據(jù)（GSE6901）來分析基因響應(yīng)脅迫的表達(dá)變化[5]。

1.4? 水稻生長和脅迫處理

本試驗所用水稻品種為Hwayoung，水稻種子經(jīng)表面消毒以后，在生根培養(yǎng)基中發(fā)芽，在光照14 h/黑暗10 h光周期條件下生長14 d，將水稻全苗放在200 mmol/L的NaCl溶液和PEG 6000溶液中處理，在0、1、3、6 h取樣，放置于超低溫冰箱中保存。

1.5? RNA的抽提、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR

總RNA用TRIzol試劑進(jìn)行抽提，4 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄，首先用1單位的DNase進(jìn)行處理，然后在20 μL包含0.5 μg Oligo（dT）、0.75 mmol/L的dNTPs和200 U的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL在10 μL體系中（引物終濃度為0.3 mmol/L、SYBR Green 5 μL）、在Stepone PCR儀上根據(jù)操作手冊進(jìn)行實時定量熒光PCR，所有引物在60 ℃退火1 min，總共40個循環(huán)。水稻Actin基因作為內(nèi)參基因，所有目標(biāo)基因的表達(dá)水平用Actin的表達(dá)進(jìn)行平衡。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 水稻糖代謝相關(guān)酶編碼基因的鑒定

2.1.1? 卡爾文循環(huán)? 用小麥的PGK蛋白質(zhì)序列在水稻數(shù)據(jù)庫（MSU）中搜索發(fā)現(xiàn)[5]，水稻中有5個同源性較高的蛋白，依次命名為OsPGK1～OsPGK5，通過序列比對和結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)OsPGK5除了含有PGK結(jié)構(gòu)域以外，還含有一個甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（圖2A），而且它的蛋白質(zhì)序列與其他蛋白同源性較低，因此認(rèn)為它不屬于磷酸甘油酸激酶家族的基因。將所有蛋白質(zhì)序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索，發(fā)現(xiàn)OsPGK4蛋白序列與MSU預(yù)測序列不一致，由于GenBank數(shù)據(jù)庫中有RNA-seq試驗數(shù)據(jù)支持基因的預(yù)測，因此其預(yù)測結(jié)果更加可靠。GenBank數(shù)據(jù)庫中OsPGK4預(yù)測蛋白僅有231個氨基酸，通過將OsPGK4的cDNA序列轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)序列然后再與其他PGK蛋白序列進(jìn)行比對，推測OsPGK4在進(jìn)化的過程中發(fā)生了突變導(dǎo)致翻譯提前終止，使得PGK結(jié)構(gòu)域發(fā)生了缺失而失去了功能（圖2B、圖2C）。

綜上所述，水稻中共有3個有功能的磷酸甘油酸激酶編碼基因（OsPGK1～OsPGK3）。由于PGK既可定位在葉綠體中也可定位在細(xì)胞質(zhì)中，在小麥中這兩種PGK均已克隆[5]，將水稻3個PGK蛋白質(zhì)序列與不同細(xì)胞定位的小麥PGK蛋白序列對比，結(jié)果表明，OsPGK1編碼蛋白定位于葉綠體，而另外2個基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用擬南芥的醛縮酶蛋白序列在水稻數(shù)據(jù)庫中搜索，發(fā)現(xiàn)水稻中共有7個FBA基因，命名為OsFBA1～OsFBA7。進(jìn)化樹分析表明OsFBA2和OsFBA5與擬南芥預(yù)測的定位在質(zhì)體中的蛋白屬于同一類，另外5個蛋白則與定位在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白屬于同一類（圖3A）。利用擬南芥的FBPase蛋白序列進(jìn)行搜索，在水稻數(shù)據(jù)庫中找到了4個同源序列，通過序列比對進(jìn)化樹分析將與擬南芥cyFBP同源的2個蛋白分別命名為OscFBP1和OscFBP2，而與擬南芥cpFBP1和cpFBP2同源的2個蛋白分別命名為OspFBP1和OspFBP2（圖3B）。在擬南芥中有2個TKL編碼基因（AtTKL1和AtTKL2），兩個蛋白均定位在葉綠體中，但表達(dá)分析表明AtTKL1在綠色組織中表達(dá)較高，推測它是參與卡爾文循環(huán)的主要轉(zhuǎn)酮酶[5]。用擬南芥AtTKL1蛋白序列進(jìn)行同源搜索，在水稻中找到2個同源蛋白，分別命名為OsTKL1和OsTKL2。擬南芥中有3個核糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶（RPI）編碼基因：At1g71100、 At2g01290 和 At3g04790，另外1個基因At5g44520編碼的蛋白序列雖然與這3個蛋白有一定的相似性，但缺少酶活關(guān)鍵的氨基酸，因此它可能催化其他反應(yīng)[21]。根據(jù)預(yù)測At1g71100和At2g01290定位在細(xì)胞質(zhì)中，而At3g04790定位在葉綠體中，可能參與卡爾文循環(huán)[21]。通過蛋白序列同源搜索，在水稻基因組中找到3個基因：LOC_Os03g56869、LOC_Os07g

08030和LOC_Os04g24140，通過序列比對和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)LOC_Os03g56869與擬南芥At5g44520同源，因此它不是水稻的RPI編碼基因，而其他2個基因編碼的蛋白與擬南芥RPI有很高的同源性（圖3C），根據(jù)它們與擬南芥兩類細(xì)胞定位不同的蛋白的同源性將LOC_Os07g08030和LOC_Os04g24140分別命名為OsRPIcyt和OsRPIchl。水稻中已發(fā)現(xiàn)了1個PRK編碼基因[9]，用這個蛋白序列進(jìn)行同源搜索，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了另外1個PRK編碼基因，并將這兩個基因分別命名為OsPRK1和OsPRK2。

2.1.2? 蔗糖合成? 在水稻中早有報道至少有2個定位于細(xì)胞質(zhì)中的PGI[10]，通過同源搜索發(fā)現(xiàn)水稻基因組共有4個PGI編碼基因，序列對比和進(jìn)化樹分析表明2個定位于細(xì)胞質(zhì)（OscPGI1和OscPGI2），另外2個定位于質(zhì)體（OspPGI1和OspPGI2）（圖3D）。

2.1.3? 淀粉合成與水解? 水稻中已經(jīng)鑒定有7個基因編碼β淀粉酶[15]，通過擬南芥的β淀粉酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)水稻中至少有10個編碼基因，進(jìn)化樹分析表明與擬南芥類似[15]，水稻的β淀粉酶也分屬4個亞家族：OsRICAMYBA和OsBAM7屬于亞家族I，OsPCT-BMYI、OsBAM5、OsBAM6和OsBAM8屬于亞家族II，OsBAM4和OsBAM10屬于亞家族III，OsBAM3和OsBAM9屬于亞家族IV（圖3E）。

2.1.4? 果糖激酶? 水稻中已鑒定了2個果糖激酶編碼基因：OsFKI和OsFKII，分別屬于I和II類果糖激酶[16]，但通過同源序列搜索發(fā)現(xiàn)水稻中還存在1個果糖激酶基因，將其命名為OsFKIII。

2.2? 糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因

2.2.1? SWEET家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白? 水稻中已鑒定有21個SWEET蛋白，通過同原序列搜索發(fā)現(xiàn)水稻中還有另外2個基因編碼SWEET蛋白：Os01g0314600和Os09g0508250，在MSU數(shù)據(jù)庫中沒有這2個基因的注釋，因此水稻共有23個SWEET蛋白編碼基因。

2.2.2? 單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族? 對擬南芥的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因的序列分析表明單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可分為7個亞家族：STP、VGT-like、PLT、INT、TMT、pGlcT和ERD6-like[22]。STP是一種細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，將質(zhì)外體的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，VGT-like蛋白可定位在液泡膜和葉綠體膜上轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，PLT蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)單糖和多糖，INT蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜上負(fù)責(zé)肌醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，TMT定位在液泡膜上負(fù)責(zé)己糖的運(yùn)輸，pGlcT蛋白在葉綠體膜上將淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，ERD6-like蛋白可能定位在液泡膜上轉(zhuǎn)運(yùn)糖類物質(zhì)。在水稻中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族共有64個基因[23]，其中STP亞家族包含28個基因（OsMST1～OsMST28），OsMST1～OsMST6和OsMST8均有文獻(xiàn)報道[5]，其他基因則按照他們在染色體上的位置順序來進(jìn)行命名。VGT-like亞家族包含2個基因（OsVGT1和OsVGT2），OsVGT1與擬南芥的AtVGT1和AtVGT2親緣關(guān)系較近，可能定位于液泡膜上，而OsVGT2與擬南芥的At5g59250較同源，可能定位在葉綠體膜上[22，23]。PLT亞家族包含15個基因（OsPLT1～OsPLT15），根據(jù)他們在染色體上的位置順序來進(jìn)行命名。INT亞家族包含3個基因（OsINT1～OsINT3），根據(jù)與他們同源的擬南芥基因來進(jìn)行命名。TMT亞家族包含6個基因（OsTMT1～OsTMT6），其中OsTMT1～OsTMT4已有文獻(xiàn)報道[5]。pGlcT包含4個基因（OspGlcT1～OspGlcT4），ERD6-like亞家族包含6個基因（OsERD6-1～OsERD6-6），均根據(jù)他們在染色體上的位置來進(jìn)行命名。

2.3? 表達(dá)譜分析

基因的表達(dá)特異性可間接地反映其功能特異性，因此為了分析糖代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)譜，利用基因的AFFY芯片探針號從CREP提取了部分基因在22個組織器官中的表達(dá)數(shù)據(jù)（部分基因沒有搜索到探針號），分別將組織器官分為源（全苗、葉片、葉鞘、開花之前的稃和浸種72 h的種子）和庫（根、莖、雄蕊、穗、小穗以及胚乳），并分析了基因的表達(dá)規(guī)律。

分析表明，在卡爾文循環(huán)中部分基因具有很高的表達(dá)特異性，包括：OsPGK1、OsFBA2、OsGAPA、OsGAPB、OsRBCS4、OsPRK1、OsSBP、OspFBP2、OsTKL1、OsRPEchl和OsRPIchl（圖4A）。這些基因在源器官中除了種子以外在其他組織中的表達(dá)量均較高，而在庫器官中的表達(dá)相對較低，但發(fā)現(xiàn)這些基因在穗和小穗中表達(dá)量與源器官中相近，這可能是由于穗和小穗中均包含了可進(jìn)行光合作用的稃片，因此推測這些基因可能是參與卡爾文循環(huán)的主要基因。同一家族的基因表達(dá)譜差異表達(dá)，這可能與其功能有一定的關(guān)系，例如甘油脫氫酶編碼基因OsGAPA和OsGAPB主要在綠色細(xì)胞中表達(dá)參與光合作用，OsGAPCp1和OsGAPCp2在除胚乳以外的庫器官中表達(dá)較高，在非綠色質(zhì)體中參與糖代謝，而OsGAPC1～OsGAPC3之間差異更為明顯，它們可能分別在不同的組織中參與糖酵解或糖異生。與擬南芥中的AtTKL1和AtTKL2表達(dá)相似，OsTKL1在綠色細(xì)胞中表達(dá)較高，而OsTKL2在胚乳中表達(dá)較高，表明OsTKL2不參與卡爾文循環(huán)。與OsPGK1在主要綠色細(xì)胞中表達(dá)相反，OsPGK2和OsPGK3在庫器官中表達(dá)較高，而且這2個蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，表明他們主要在庫器官中參與糖酵解或糖異生（圖4A）。

蔗糖合成與降解相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)沒有規(guī)律性，大部分基因呈現(xiàn)組成性表達(dá)，僅有少部分基因表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性，例如：OsCIN1、OsCIN5和OsNIN7在源器官中表達(dá)相對較高，OsCIN6和OsCIN7僅在種子和根中表達(dá)較高，由于蔗糖的降解產(chǎn)物還可用于合成其他糖類物質(zhì)，推測這些基因在部位的表達(dá)可能與這些糖類物質(zhì)的合成有關(guān)（圖4B）。沒有發(fā)現(xiàn)在源器官中表達(dá)相對較高的與蔗糖合成相關(guān)酶編碼基因，表明這些基因在其他組織器官中也有很重要的作用（圖4B）。與小麥中相似，水稻OsSPS1和OsSPP1隨著胚乳的發(fā)育表達(dá)逐漸升高（圖4B），推測這些酶可能與蔗糖分解與再合成形成的無效循環(huán)有關(guān)，而這個無效循環(huán)可增加對碳水化合物代謝調(diào)控的靈活性[24]。

淀粉合成與降解相關(guān)酶編碼基因中有一部分表達(dá)呈現(xiàn)很強(qiáng)的組織特異性，例如：OsAGPS1、OsAGPS2、OsSSI、OsAGPL2、OsSSIIa、OsGBSSI、OsBEI、OsBEIIb、OsSSIIIa、OsISA1和OsISA2，這些基因在胚乳中表達(dá)較高，表明這些基因產(chǎn)物主要在胚乳發(fā)育的過程中催化淀粉的合成（圖4C）。α淀粉酶編碼基因大部分在種子中表達(dá)較高與淀粉的降解有關(guān)，但有部分基因也在胚乳中表達(dá)，目前還不知道它們在胚乳的發(fā)育中有何作用，有部分淀粉降解酶編碼基因如OsAmy3D、OsRICAMYBA、OsBAM7、OsBAM8、OsGWD1和OsSEX4在葉片中表達(dá)也較高，表明水稻葉片可能暫時儲藏淀粉，OsGWD1和OsSEX4在莖中表達(dá)水平也比較高，他們可能參與莖中暫時儲藏淀粉的分解，但他們的積累是在抽穗以前，抽穗以后表達(dá)明顯下降（圖4C）。除此之外，OsBAM4、OsBAM6、OsBAM6、OsGWD1和OsSEX4在雄蕊中表達(dá)水平很高，他們可能在雄配子體發(fā)育過程中降解淀粉合成其他碳水水化合物（圖4C）。

己糖激酶和果糖激酶中精油OsHXK6在源器官中表達(dá)比庫器官高，OsHXK4、OsHXK8和OsFKI在種子中表達(dá)較高，OsHXK1、OsHXK2、OsHXK5和OsHXK10在雄蕊中表達(dá)較高，表明不同的果糖激酶在不同的組織器官中發(fā)揮作用（圖4D）。單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中僅有部分STP類編碼基因具有一定的表達(dá)特異性，在源器官表達(dá)較高，同時在根中有很高的表達(dá)，另外還有部分單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在雄蕊中表達(dá)較高，其他基因表達(dá)沒有規(guī)律性（圖5A）。磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因（OsTPT1和OsTPT2）在源器官表達(dá)水平較高，進(jìn)一步表明他們主要在葉綠體中轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸丙糖（圖5B）。磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因OsGPT1和OsGPT2的表達(dá)具有一定的互補(bǔ)性，OsGPT1在葉片中表達(dá)較低，在胚乳發(fā)育早期表達(dá)較高，OsGPT2則在葉片和胚乳發(fā)育的晚期表達(dá)較高，表明他們可能在不同的組織器官轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸葡萄糖（圖5B）。ADP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因（OsBT1-1）主要在胚乳中表達(dá)，麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因OsMEX1在雄蕊和穗中表達(dá)較高，在葉片中表達(dá)較低，與之前報道的表達(dá)譜相似（圖5B）。SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中OsSWEET1b在源器官和胚乳中表達(dá)較高，OsSWEET11和OsSWEET15傾向于在庫器官中表達(dá)，OsSWEET5與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因OsSUT3表達(dá)譜非常相似，在根、雄蕊和穗中表達(dá)量最高。其他蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)沒有呈現(xiàn)很強(qiáng)的組織特異性（圖5B）。

2.4? 響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

有研究表明有些參與糖代謝的酶參與植株的抗逆性。在水稻中3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因OsGAPC3可被鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)OsGAPC3可提高植株的抗鹽性[5]，在煙草中超表達(dá)磷酸甘油酸激酶編碼基因OsPgk2a-P可在鹽脅迫下提高煙草的產(chǎn)量[5]，還有研究表明在缺水的脅迫下，蔗糖合酶和淀粉分支酶的活性會顯著升高，從而提高子粒灌漿的速率[25]。為了分析糖代謝相關(guān)酶編碼基因和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因受非生物脅迫的表達(dá)變化，從GEO數(shù)據(jù)庫中提取了干旱和鹽脅迫處理的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，并用AFFY芯片探針號進(jìn)行搜索，共得到120個糖代謝相關(guān)酶編碼基因和66個糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。

結(jié)果表明，糖代謝相關(guān)酶編碼基因中，受干旱脅迫影響有33個基因上升表達(dá)，32個基因下降表達(dá)，受鹽脅迫影響16個基因上升表達(dá)，15個基因下降表達(dá)（表1）。糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因中，受干旱脅迫影響有21個基因上升表達(dá)，22個基因下降表達(dá)，受鹽脅迫影響10個基因上升表達(dá)，12個基因下降表達(dá)（表2）。選取了幾個具有顯著性差異的基因，利用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行了驗證（圖6），結(jié)果與芯片表達(dá)數(shù)據(jù)一致。進(jìn)一步分析芯片表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在源器官特異表達(dá)的參與卡爾文循環(huán)的基因除了OsFBA2，其他均受干旱影響下降表達(dá)，表明逆境脅迫下光合速率下降的其中一個原因是參與卡爾文循環(huán)的酶的合成受到了抑制，致使其碳同化的能力下降（表1）。許多參與蔗糖降解的蔗糖合酶和轉(zhuǎn)化酶參與淀粉降解的酶編碼基因受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這可能與植物在受逆境脅迫以后需要大量的小分子可溶性糖來進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)有關(guān)（表1）。還發(fā)現(xiàn)同一種酶的不同編碼基因受逆境脅迫影響不同，例如轉(zhuǎn)酮酶編碼基因OsTKL1受干旱脅迫影響下降表達(dá)，而OsTKL2上升表達(dá)，由于2個基因的表達(dá)模式具有明顯的差異，因此推測2個基因可能參與不同的生化途徑，并在抗逆境脅迫中起不同的作用（表1）。糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因中大部分蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明在逆境條件下需要加快蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)來供應(yīng)能量（表2）。其他家族的基因受逆境脅迫影響既有上升表達(dá)基因也有下降表達(dá)基因，推測不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在逆境脅迫中起不同的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)[J].第3版.北京：高等教育出版社，2012，

[2] BUCHANAN B B，GRUISSEM W，JONES R L. Biochemistry & molecular biology of plants，2nd edition[M].Hoboken：Wiley，2015.

[3] LLOYD J R，KOSSMANN J，RITTE G. Leaf starch degradation comes out of the shadows[J].Trends in plant science，2005，10（3）：130-137.

[4] HIROSE T，ENDLER A，OHSUGI R. Gene expression of enzymes for starch and sucrose metabolism and transport in leaf sheaths of rice （Oryza sativa L.） during the heading period in relation to the sink to source transition[J].Plant Prod Sci，1999， 2：178-183.

[5] WANG L，XIE W B，CHEN Y，et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice[J].The plant journal，2010，61：752-766.

[6] ZHANG X H，RAO X L，SHI H T，et al. Overexpression of a cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene OsGAPC3 confers salt tolerance in rice[J].Plant cell tissue & organ culture，2011，107：1-11.

[7] CHEN X，XIONG J，YU T，et al. Molecular cloning and characterization of rice sedoheptulose-1，7-bisphosphatase gene that is regulated by environmental stresses[J].Journal of plant biochemistry & biotechnology，2004，13：93-99.

[8] KOPRIV，S，KOPRIVOVA A，S？譈SS K H. Identification，cloning， and properties of cytosolic D-Ribulose-5-phosphate 3-Epimerase from higher plants[J].J Biol Chem，2000，275：1294-1299.

[9] CHEN X，YU T，XION，J， et al. Molecular cloning and expression analysis of rice phosphoribulokinase gene that is regulated by environmental stresses[J].Mol Biol Rep，2004，31：249-255.

[10] NOZUE F，UMEDA M，NAGAMURA Y，et al. Characterization of cDNA encoding for phosphoglucose isomerase of rice（Oryza sativa L.）[J].DNA Seq，1996，6：127-135.

[11] LUNN J E. Sucrose-phosphatase gene families in plants[J].Gene，2003，303：187-196.

[12] JI X，ENDE W V D，LAERE A V，et al. Structure，evolution，and expression of the two invertase gene families of rice[J].J Mol Evol，2005，60：615-634.

[13] FU F F，XUE H W. Coexpression analysis identifies rice starch regulator 1，a rice AP2/EREBP family transcription factor，as a novel rice starch biosynthesis regulator[J].Plant physiol，2010，154：927-938.

[14] 廖登群，張洪亮，李自超，等.水稻（Oryza sativa L.） α-淀粉酶基因的進(jìn)化及組織表達(dá)模式[J].作物學(xué)報，2010，36（1）：17-27.

[15] FULTON D C，STETTLER M，METTLER T，et al. β-AMYLASE4，a noncatalytic protein required for starch breakdown，acts upstream of three active b-amylases in Arabidopsis chloroplasts[J].The plant cell，2008，20：1040-1058.

[16] JIANG H，DIAN W，LIU F，et al. Isolation and characterization of two fructokinase cDNA clones from rice[J].Phytochemistry，2003，62（1）：47-52.

[17] TOYOTA K，TAMURA M，OHDAN T，et al. Expression profiling of starch metabolism-related plastidic translocator genes in rice[J].Planta，2006，223（2）：248-257.

[18] HU D，LI Y，JIN W，et al. Identification and characterization of a plastidic adenine nucleotide uniporter（OsBT1-3） required for chloroplast development in the early leaf stage of rice[J].Scientific reports，2017，7：41355.

[19] YUAN M，ZHAO J，HUANG R，et al. Rice MtN3/saliva/SWEET gene family：Evolution，expression profiling，and sugar transport[J].J Integr Plant Biol，2014，56：559-570.

[20] RYOO N，EOM J S，KIM H B，et al. Expression and functional analysis of rice plastidic? maltose transporter，OsMEX1[J].J Korean Soc Appl Biol Chem，2013，56：149-155.

[21] KUNZ H H，ZAMANI-NOUR S，H？魧USLER R E，et al. Loss of cytosolic phosphoglucose isomerase affects carbohydrate metabolism in leaves and is essential for fertility of Arabidopsis[J].Plant physiol，2014，166：753-765.

[22] B？譈TTNER M. The monosaccharide transporter（-like） gene family in Arabidopsis[J].FEBS Letters，2007，581：2318-2324.

[23] JOHNSON D A，THOMAS M A. The monosaccharide transporter gene family in Arabidopsis and rice：A history of duplications，adaptive evolution，and functional divergence[J].Mol Biol Evol，2007，24：2412-2423.

[24] CASTLEDEN C K，AOKI N，GILLESPIE V J，et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J].Plant physiol，2004，135：1753-1764.

[25] YANG J，ZHANG J，WANG Z，et al. Activities of enzymes involved in sucrose-to-starch metabolism in rice grains subjected to water stress during filling[J].Field crops research，2003，81：69-81.