胰島素合成異常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

李昱芃 綜述 馮文利 審校

近年來，糖尿病成為危害人類健康的最常見疾病之一。2010年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，糖尿病患病率已達(dá)到11.6%，有50%的成年人正處于糖尿病前期[1]。胰島β細(xì)胞功能異常是糖尿病發(fā)病的重要病理機(jī)制，胰島素合成絕對(duì)和(或)相對(duì)缺乏是各型糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵原因[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成折疊、修飾加工與質(zhì)量監(jiān)控的重要場(chǎng)所，其穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)于維持正常的細(xì)胞功能有重要意義。胰島素是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成加工，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能正常對(duì)于胰島素的正確生物合成加工及折疊，發(fā)揮正常生理功能至關(guān)重要。

1 胰島素的生物合成機(jī)制

胰島素基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯形成前胰島素原，由信號(hào)肽、胰島素B鏈、C肽和A鏈組成。前胰島素原在信號(hào)肽引導(dǎo)下，跨膜轉(zhuǎn)位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后信號(hào)肽被切除，形成胰島素原[3]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，胰島素原在分子伴侶協(xié)助下完成氧化折疊，形成3對(duì)高度保守的二硫鍵(B7-A7、B19-A20和A6-A11)，其正確配對(duì)在胰島素完成正確折疊、達(dá)到其正?？臻g構(gòu)象的過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。正確折疊的胰島素原以二聚體形式出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體后，形成六聚體，并在激素原轉(zhuǎn)化酶作用下，切掉C肽后，形成成熟的胰島素分子。

2 折疊異常的胰島素原形成

正常生理過程中，可有15%新合成的胰島素原出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊[5]，錯(cuò)誤折疊的胰島素原可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)識(shí)別，進(jìn)行再折疊達(dá)到正?？臻g構(gòu)象，對(duì)于再折疊后結(jié)構(gòu)仍不正常的胰島素原，細(xì)胞將通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)或自噬系統(tǒng)降解[6, 7]。諸多原因可引起胰島素折疊異常，結(jié)構(gòu)異常的胰島素前體可大量增多，堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加重，形成對(duì)β細(xì)胞的“二次打擊”，加速β細(xì)胞功能的衰竭[2]。

3 胰島素原折疊異常引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路

折疊異常的胰島素原超出ERAD或自噬機(jī)制的處理能力，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，啟動(dòng)非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，細(xì)胞通過減少基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，減少蛋白質(zhì)合成，降低進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶表達(dá)，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊作用，并上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)降解途徑，減少折疊異常蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的堆積。蛋白質(zhì)正確折疊需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶及折疊蛋白參與，主要有糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78、鈣聯(lián)接蛋白/鈣網(wǎng)織蛋白(CNX/CRT)及巰基氧化還原酶。

GRP78也稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要分子伴侶。Bip與待折疊多肽片段相互作用形成結(jié)合—解離循環(huán)。該循環(huán)中Bip與ATP形成復(fù)合物，DnaJ與待折疊多肽形成復(fù)合物，通過J結(jié)構(gòu)域與Bip發(fā)生接觸，形成Dnaj-Bip-ATP-多肽復(fù)合物。DnaJ可激活Bip的ATP酶活性，使其脫去1分子磷酸，形成DnaJ-Bip-ADP-多肽復(fù)合物，降低多肽與Bip的親和力，釋放該多肽[8]。正常情況下，Bip與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的PERK、IRE1、ATF6結(jié)合，使其處于未激活態(tài)。但是當(dāng)未折疊蛋白大量增加時(shí)，Bip與上述三種蛋白結(jié)合減少，激活了這些蛋白及UPR。

目前已知的UPR信號(hào)通路包括[7, 9, 10]：PERK-真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)-活性轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)-CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein homologeus protein，CHOP)、肌醇依賴跨膜激酶/核酸內(nèi)切酶1(inositol-requiring transmembrane kinase/endoribonuclease 1，IRE1)-X 盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)和活性轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。這三個(gè)通路協(xié)同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中感應(yīng)蛋白負(fù)荷、蛋白折疊能力、共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)及蛋白修飾，以滿足ER蛋白折疊的需求[11]。在胰島β細(xì)胞中，PERK- eIF2α-ATF4-CCAAT/ CHOP通路可以迅速減少胰島素生物合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高負(fù)荷引起ER Stress。IRE1-XBP1及ATF6通路可提高前述ER分子伴侶的基因轉(zhuǎn)錄，增加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)折疊的能力。

3.1 PERK- eIF2α-ATF4-CCAAT/CHOP通路 蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜蛋白，有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，也稱為elF2α激酶3，是最早發(fā)現(xiàn)的與β細(xì)胞功能緊密相關(guān)的ER感應(yīng)蛋白[12]，PERK可以特異性地磷酸化eIF2α的Ser51位點(diǎn),進(jìn)而抑制胞內(nèi)蛋白合成，PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化是胰島素原生物合成的重要負(fù)調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。但并非我們推測(cè)的PERK活性下降，可以增加胰島素原合成，對(duì)β細(xì)胞功能有益，缺乏PERK可導(dǎo)致Wolcott-Rallison綜合征，引起新生兒糖尿病[13]。PERk敲除可引起胰島素原過度合成引發(fā)胰島素原錯(cuò)誤折疊增加，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡[14]。但也有研究報(bào)道在PERK敲除的小鼠中，β細(xì)胞凋亡并未增加，只是在胚胎期和新生期β細(xì)胞增殖受到抑制[15]。有研究發(fā)現(xiàn)在PERK缺陷的β細(xì)胞中，總蛋白及胰島素原合成并未脫抑制，胰島素原蓄積導(dǎo)致的ER應(yīng)激可能并非是由于過度合成[16]，可能的解釋是胰島素原出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的出口及遠(yuǎn)端分泌間隔被阻滯，此外，質(zhì)量控制系統(tǒng)及ERAD異常也導(dǎo)致胰島素原和其他的分泌蛋白及膜蛋白在ER蓄積。在PERK缺陷細(xì)胞中，胰島素原和皰疹性口炎病毒(VSVG)的轉(zhuǎn)運(yùn)被阻滯，錯(cuò)誤折疊蛋白出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重新轉(zhuǎn)位機(jī)制(ERAD的重要環(huán)節(jié))也被阻斷，大量胰島素原蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，提示了ERAD途徑功能異常[16]。

總之，PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化在胰島素原合成、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制中有重要作用[17]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。eIF2α的Ser51位點(diǎn)磷酸化可進(jìn)一步激活A(yù)TF4的轉(zhuǎn)錄，ATF4可增加GADD34的轉(zhuǎn)錄，該蛋白可發(fā)揮反饋調(diào)控作用，抑制eIF2α磷酸化，恢復(fù)正常的蛋白合成。ATF4同時(shí)還可增加CHOP(也被稱作GADD153)的轉(zhuǎn)錄，該蛋白的增多可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞因子及棕櫚酸作用于ATF4及AP-1調(diào)節(jié)CHOP表達(dá)[18]，但與SERCA泵抑制劑環(huán)匹阿尼酸不同，ATF4不通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)反應(yīng)原件(ERSE)調(diào)節(jié)CHOP。CHOP還可以激活ERO1和死亡受體(DR)5等，ERO1編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶[19]，DR5編碼的死亡受體可以激活caspases蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡[20]。GADD34可與蛋白磷酸酶2C結(jié)合能促進(jìn)eIF2α去磷酸化，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的生物合成[21]。CHOP可與cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白CREB形成二聚體抑制Bcl-2表達(dá)，增加線粒體對(duì)促凋亡因素的敏感性[22]。

3.2 IRE1-XBP1通路 IRE1作為一種跨膜激酶和核酸內(nèi)切酶，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)有重要作用。在哺乳動(dòng)物存在α、β兩個(gè)亞型，二者均可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的蓄積而激活。IRE1α普遍存在于組織細(xì)胞中，在胰腺和胎盤尤其高表達(dá)，IRE1β在腸上皮細(xì)胞特異表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起IRE1與Bip解離，IRE發(fā)生自身磷酸化，激活自身核酸內(nèi)切酶活性[23]，其底物是XBP1的mRNA，XBP1mRNA被切割下一個(gè)26個(gè)核酸的內(nèi)含子后成為成熟的mRNA，其編碼的XBP1可與涉及蛋白折疊的靶基因的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)原件結(jié)合，如Bip，可增加其轉(zhuǎn)錄活性[12]，并可上調(diào)ERAD相關(guān)組份。但敲除IREα及β并未減少Bip及GRP94等UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，提示其還被其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)因子調(diào)控[24]。β細(xì)胞中IRE1α的激酶活性可被葡萄糖激活。但是葡萄糖誘導(dǎo)的IRE1α磷酸化與其和Bip的結(jié)合及解離無關(guān)，提示了其特殊的調(diào)控機(jī)制。短期高血糖可選擇性激活I(lǐng)RE1α的磷酸化，增加胰島素生物合成，但長期高血糖會(huì)導(dǎo)致其激酶和核酸內(nèi)切酶活性均增高，導(dǎo)致高糖毒性和β細(xì)胞衰竭[25]。在長期嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1α催化活性受到復(fù)雜的調(diào)控，并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的ins mRNA減少和β細(xì)胞凋亡[26]。研究發(fā)現(xiàn)，腳手架(Scaffold)蛋白R(shí)ACK1以分子開關(guān)的方式，在胰島β細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，葡萄糖刺激下，IRE1α可與RACK1相互作用，而RACK1可與蛋白磷酸酶PP2A結(jié)合，高糖刺激下形成RACK1、PP2A和IRE1α復(fù)合物，使IRE1α去磷酸化調(diào)控其激活水平，長期高糖刺激或ER應(yīng)激條件下，PP2A與RACK1解離，使得與RACK1結(jié)合的IRE1α磷酸化水平穩(wěn)定不變，提示RACK1在維持ER穩(wěn)態(tài)中的重要作用[27]。IRE1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)，并與之結(jié)合，TRAF2可以使死亡受體DR及JNK和應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)偶聯(lián)，進(jìn)一步激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)[28]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRAF2還可以切割caspase12，激活caspase3、9，引起細(xì)胞凋亡。在caspase12敲除的細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能誘導(dǎo)其凋亡，提示了其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的特異性調(diào)節(jié)因子[29]。近期發(fā)現(xiàn)一個(gè)稱為KIRAs(Kinase-inhibiting RNase Attenuators)的小分子家族，可以使Akita小鼠的胰島素合成和分泌增加[30]。

3.3 ATF6通路 ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量90 ku。N端胞內(nèi)區(qū)有一個(gè)堿性鋅指結(jié)構(gòu)(bZIP)的DNA轉(zhuǎn)錄激活域，C端管腔內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。ATF6轉(zhuǎn)移至高爾基體內(nèi)后，在高爾基體內(nèi)，ATF6被蛋白水解(site-1 protease、site-2 protease)處理，釋放N端的50 ku結(jié)構(gòu)域，然后該結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移入核，扮演轉(zhuǎn)錄因子的角色，調(diào)控Bip、GRP94、ERO1β等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因，及HERP等ERAD組份[31, 32]。在體外培養(yǎng)的β細(xì)胞中，敲除ATF6可導(dǎo)致JNK、p38、C-Jun磷酸化增加，并使細(xì)胞容易發(fā)生凋亡。抑制JNK或p38磷酸化可防止ATF6缺陷相關(guān)的凋亡，表明即使在無氧化應(yīng)激情況下，ATF6在維持β細(xì)胞生存方面也起著重要作用[33]。但是，在小鼠體內(nèi)大范圍敲除ATF6α，雖然在高脂飲食條件下，小鼠存在糖耐量減低，胰島素含量輕度下降，但在正常飲食條件下沒有檢測(cè)到β細(xì)胞功能異常或糖尿病表型[34]。這些都表明在應(yīng)激條件下，ATF6發(fā)揮重要作用。ATF6誘導(dǎo)表達(dá)CHOP/GADD153，在非應(yīng)激條件下，CHOP主要存在于胞漿，表達(dá)量較少，應(yīng)激狀態(tài)時(shí)大量表達(dá)，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[35]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，敲除CHOP的細(xì)胞凋亡較wild type細(xì)胞明顯減少，而其過表達(dá)的細(xì)胞，則凋亡增加[22]。CHOP可激活GADD34、ERO1及DR5等凋亡蛋白，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

4 未折疊胰島素原的降解途徑

在β細(xì)胞蓄積的錯(cuò)誤折疊胰島素原主要通過泛素-蛋白酶體系降解，泛素化如同給錯(cuò)誤折疊的胰島素原貼上標(biāo)簽，以利于進(jìn)一步降解處理。該過程有泛素激活酶E1、E2、E3共同完成，是一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)錯(cuò)誤折疊的胰島素原誘發(fā)UPR，也同時(shí)啟動(dòng)ERAD，有許多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶如Bip/GRP78、EDEM1、OS9及STP3B可能參與錯(cuò)誤折疊的胰島素原的識(shí)別和招募到ERAD復(fù)合體，這些分子伴侶以糖基化或非糖基化形式與未折疊胰島素原結(jié)合，再將其轉(zhuǎn)運(yùn)到Sel1L-Hrd1 ERAD復(fù)合體[36-38]。

Hrd1可以與Sel1L(又稱Hrd3)形成復(fù)合體負(fù)責(zé)錯(cuò)誤折疊胰島素原的降解。Hrd1胞漿側(cè)尾部有一個(gè)有E3連接酶活性的指環(huán)狀催化結(jié)構(gòu)，以及一個(gè)長的富含脯氨酸的C端。Hrd1的跨膜區(qū)域可形成一個(gè)逆轉(zhuǎn)位通道，排出蛋白[39]。隨著逆轉(zhuǎn)位到胞漿，錯(cuò)誤折疊的胰島素原被泛素化，在P97(VCP/CDC48)的幫助下，被蛋白酶體降解。指環(huán)結(jié)構(gòu)有兩個(gè)作用：(1)作為其Hrd1依賴的auto泛素化通道功能的門戶[39]。(2)Hrd1催化錯(cuò)誤折疊底物的泛素化一旦暴露于胞漿，即被打上標(biāo)簽，以便于被蛋白酶體降解。近期研究提示，另一個(gè)E3連接酶gp78(可能位于Sel1-Hrd1復(fù)合體的下游或平行)可以促進(jìn)逆轉(zhuǎn)位的蛋白底物的溶解度[40]。

Hrd1活性可被多種機(jī)制調(diào)節(jié)。除了被胞外信號(hào)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)，兩個(gè)最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制是Hrd1自身泛素化及與Sel1L相互作用[41]。Sel1L是一個(gè)跨膜蛋白，可以形成二聚體或寡聚體與Hrd1的N端區(qū)域相互作用[42]。Sel1L在哺乳動(dòng)物的Hrd1 ERAD復(fù)合體可能不是必須的，是維持Hrd1穩(wěn)定所必須的，可以和Hrd1發(fā)生相互作用，也為Hrd1招募底物[43]。Sel1L缺失會(huì)導(dǎo)致成年小鼠在3周內(nèi)死亡，并伴有嚴(yán)重胰腺萎縮；Sel1L缺失還會(huì)引起Hrd1不穩(wěn)定及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促使胰腺細(xì)胞死亡；并導(dǎo)致核糖體大小亞基聚合，減少蛋白質(zhì)翻譯[44]。

錯(cuò)誤折疊的胰島素原是誘發(fā)β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要分子基礎(chǔ)，UPR及其誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，ERAD均參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，有一些機(jī)制尚不明確。降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可緩解β細(xì)胞功能衰竭，靶向干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能成為糖尿病治療的新靶點(diǎn)。4-苯基丁酸、?；敲撗跄懰岬确肿影閭H均可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕β細(xì)胞損傷[45]。此外，提高ERAD及細(xì)胞自噬效率，上調(diào)UPR下游信號(hào)通路也可增加β細(xì)胞對(duì)錯(cuò)誤折疊胰島素原的處理能力(如增加XBP-1、調(diào)節(jié)Perk-eIF2α通路等)，也可減少錯(cuò)誤折疊的胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積，進(jìn)而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。深入的了解胰島素錯(cuò)誤折疊與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)機(jī)制，對(duì)于更深刻理解糖尿病的發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)治療新靶點(diǎn)有重要意義。