腦膠質(zhì)瘤移植模型的研究進(jìn)展

武衛(wèi)周，鐘士江，王 莉 綜述 朱 政 審校

膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的30%[1]，據(jù)估計(jì)在我國(guó)每年有近6萬(wàn)名患者被診斷為腦膠質(zhì)瘤[2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)其組織學(xué)特征，將腦膠質(zhì)瘤分為四級(jí)：Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤，Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤，隨著級(jí)別的升高膠質(zhì)瘤的惡性程度隨之升高[3]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM，WHO Ⅳ級(jí))是最常見的惡性膠質(zhì)瘤，目前對(duì)GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)切除、術(shù)后放化療等。但由于其侵襲力強(qiáng)，復(fù)發(fā)率高，即使采用標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，GBM患者從診斷到死亡的平均生存期僅為14.6個(gè)月，5年生存率為9.8%[4]。膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性必然導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的不完全切除，盡管神經(jīng)腫瘤學(xué)近年來(lái)取得了很大進(jìn)展，但腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不盡人意，這表明仍需要針對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行不斷的研究。而腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的建立對(duì)膠質(zhì)瘤的研究有至關(guān)重要的作用。目前已創(chuàng)建了多種膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，根據(jù)獲得腫瘤的來(lái)源不同，可分為化學(xué)誘導(dǎo)模型、移植模型和基因工程模型[5]，在醫(yī)學(xué)科研中應(yīng)用最多的是移植模型。筆者對(duì)近年來(lái)一些常用腦膠質(zhì)瘤移植模型的種類、特征及建模方法進(jìn)行綜述。

1 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

目前，國(guó)內(nèi)外已建立了許多具有不同生物學(xué)特征的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。常用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株有C6、F98、9L、SHG-44、U87MG等。其中：C6、F98、9L細(xì)胞屬于鼠源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞[6-8]，SHG-44、U87MG細(xì)胞屬于人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞[9, 10]。

1.1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株是Wistar大鼠經(jīng)N2亞硝基甲脲誘發(fā)的大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，該細(xì)胞在體內(nèi)、體外均可傳代培養(yǎng)，其生長(zhǎng)穩(wěn)定。移植動(dòng)物常選擇Wistar大鼠、SD大鼠，形成的顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)快，成瘤率高，且腫瘤內(nèi)有新生血管，周圍有炎性反應(yīng)。對(duì)于C6/SD大鼠模型，形成的移植瘤邊界清楚，有包膜，類似人腦自發(fā)性腫瘤。文獻(xiàn)[11]也提到，由于C6 細(xì)胞有很強(qiáng)的免疫原性，在SD大鼠顱內(nèi)形成的移植瘤不能持續(xù)生長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)自然消退現(xiàn)象，故此模型不適合應(yīng)用于膠質(zhì)瘤免疫及基因免疫治療等相關(guān)研究。而C6/Wistar大鼠模型，具有腦膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性特征，移植瘤與周圍正常腦組織邊界不清，微血管豐富，灶內(nèi)局部有壞死現(xiàn)象，其生長(zhǎng)特點(diǎn)及腫瘤形態(tài)與GBM較為接近，可作為臨床腦膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究的理想模型。

1.2 F98膠質(zhì)瘤細(xì)胞 F98細(xì)胞株是BD IX孕大鼠靜脈注射N-乙基-N-亞硝基脲誘導(dǎo)產(chǎn)生的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，鏡下可見:大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，少數(shù)為圓形、橢圓形，其形成的移植瘤呈侵襲性生長(zhǎng)，新生血管豐富[12]。F98膠質(zhì)瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)弱[13]，這使它成為研究膠質(zhì)瘤免疫耐受機(jī)制的理想模型，同時(shí)也被用于研究人腦膠質(zhì)瘤分子的遺傳學(xué)改變[14]。F98細(xì)胞移植于Fischer344大鼠腦干內(nèi)，可形成腦干腫瘤模型，其腫瘤的組織病理學(xué)和放射生物學(xué)特征與侵襲性的原發(fā)性腦干腫瘤相似，這將有助于檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)性腫瘤藥物的療效。

1.3 9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞 9L膠質(zhì)肉瘤是目前應(yīng)用最廣泛的大鼠腦腫瘤模型。9L細(xì)胞是N-甲基亞硝基脲注射到F344大鼠體內(nèi)誘發(fā)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞[15]，其組織相容性基因復(fù)合體與 F344 大鼠有較高的同源性，且腫瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)與人腦膠質(zhì)瘤接近。將9L細(xì)胞移植到Fischer344大鼠體內(nèi)，形成的移植瘤鏡下觀察細(xì)胞為梭形，呈肉瘤狀，腫瘤邊界較清晰。Nagaraja 等[16]經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠顱內(nèi)9L腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有Vimentin表達(dá)，腫瘤內(nèi)部及周邊的GFAP表達(dá)為陽(yáng)性。盡管9L細(xì)胞在Fischer344大鼠體內(nèi)產(chǎn)生，但它也能在異基因Wistar大鼠體內(nèi)形成腫瘤，其移植瘤為局限性腫塊，對(duì)周圍組織無(wú)浸潤(rùn)，不擴(kuò)散到蛛網(wǎng)膜下腔或腦室。近年來(lái)，在9L細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞，在體外可分化為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞形成的腫瘤比親本9L腫瘤更具侵襲性。2016年王鳳等[17]利用流式技術(shù)分選的9L 腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接種于Fischer344大鼠顱內(nèi)，建立了穩(wěn)定的腦膠質(zhì)瘤模型，并證實(shí)具有惡性膠質(zhì)瘤生物學(xué)特征。

1.4 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87膠質(zhì)瘤(U87-MG)細(xì)胞株來(lái)源于人源性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，屬于WHO Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相似[18]。相對(duì)移植動(dòng)物而言，U87-MG屬于異源性細(xì)胞，接種到動(dòng)物體內(nèi)時(shí)會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，造成移植瘤生長(zhǎng)緩慢、受限，甚至出現(xiàn)不成瘤現(xiàn)象。但移植于免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)時(shí)，很少會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，且形成的腫瘤能表現(xiàn)出高度細(xì)胞異型性，如核分裂象、不規(guī)則核仁及豐富的微血管等[19]，但缺乏人腦膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性特征，形成的移植瘤邊界清晰，周圍有反應(yīng)性細(xì)胞增生。因此，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞一般選擇免疫缺陷的裸鼠作為接種對(duì)象。

1.5 SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)源于人額葉星形細(xì)胞瘤，屬于WHO Ⅱ-Ⅲ級(jí)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。體外傳代培養(yǎng)，生長(zhǎng)良好，鏡下細(xì)胞呈星形和梭形，含有膠質(zhì)纖維和微絲。一般移植于裸鼠顱內(nèi)尾狀核。但在一些文獻(xiàn)中，SHG-44細(xì)胞采用的移植鼠為Wistar大鼠，屬于異種移植，預(yù)先進(jìn)行免疫抑制，也可建立穩(wěn)定的膠質(zhì)瘤模型。2015年李英夫等[20]采用立體定向技術(shù)將SHG-44細(xì)胞移植于Wistar大鼠腦內(nèi)尾狀核，術(shù)前3 d給予地塞米松降低免疫反應(yīng)，形成的移植瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，中心有壞死灶，邊界不清，移植瘤細(xì)胞呈星形或橢圓形，核分裂象可見，符合人腦GBM的特征。因此，Wistar 大鼠 SHG-44 腦膠質(zhì)瘤模型也可用于臨床膠質(zhì)瘤研究。

此外，文獻(xiàn)[21-24]也提到應(yīng)用U251、U373、Hs683、GBM22等細(xì)胞制作腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型。而建模常用的動(dòng)物有Wistar大鼠、 SD大鼠、Fischer344大鼠、BALB/c裸鼠、SCID 鼠等。腦膠質(zhì)瘤移植模型根據(jù)瘤細(xì)胞與接種動(dòng)物之間的種屬差異性，可分為異種移植和同種移植模型；根據(jù)移植部位不同，可分為異位移植和原位移植模型。

2 建模方法

2.1 異位移植模型 腦膠質(zhì)瘤異位移植是將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液(或組織)移植到動(dòng)物的皮下形成移植瘤。此模型具有操作簡(jiǎn)單，成瘤率高，易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，測(cè)量腫瘤的體積等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以通過觀察腫瘤的變化來(lái)確定藥物的療效。不足之處：首先，這種移植瘤并未生長(zhǎng)在顱內(nèi)，移植瘤細(xì)胞所處的生長(zhǎng)環(huán)境與原發(fā)部位有很大差別，導(dǎo)致移植瘤的生物學(xué)行為與原腫瘤有所不同，不能真正體現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤的特征；其次，血腦屏障的缺失，這將對(duì)實(shí)驗(yàn)藥物清除動(dòng)力學(xué)方面的研究產(chǎn)生影響[25]。因此，對(duì)于腦膠質(zhì)瘤研究來(lái)說(shuō)，這種異位移植并不是理想的模型。

2.2 原位移植模型 腦膠質(zhì)瘤原位移植是在移植動(dòng)物顱內(nèi)建立移植瘤，該移植瘤無(wú)論是在組織形態(tài)學(xué)，還是在分子生物學(xué)方面都能很好地保持人腦膠質(zhì)瘤的特征。此方法操作技術(shù)要求高，定位要準(zhǔn)確，而操作手法及接種部位直接影響著成瘤率。隨著立體定位儀的發(fā)明，大大提高了原位移植的成瘤率，從而使腦膠質(zhì)瘤原位移植模型在臨床研究中得到了廣泛應(yīng)用。與皮下移植瘤模型相比, 原位移植瘤模型具有腫瘤原發(fā)位點(diǎn)的典型特征，這使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近臨床。建立腦膠質(zhì)瘤原位移植模型常用兩種方法：徒手移植法、立體定向法。

2.2.1 徒手移植法 徒手操作法是將人腦膠質(zhì)瘤組織切成碎塊，通過開顱手術(shù)的方法，接種于移植鼠的顱內(nèi)。此方法操作簡(jiǎn)單，技術(shù)含量低，不受實(shí)驗(yàn)環(huán)境限制，便于開展。但對(duì)移植動(dòng)物來(lái)說(shuō)，創(chuàng)傷大，操作時(shí)間長(zhǎng)，定位不準(zhǔn)確，術(shù)后移植鼠死亡率高，成瘤率低，而且腫瘤組織塊僅置于了腦表面，未能形成正真的腦內(nèi)移植瘤，無(wú)法滿足科研需求。

2.2.2 立體定向法 立體定向技術(shù)的發(fā)明對(duì)腦腫瘤原位模型領(lǐng)域來(lái)說(shuō)是一次飛躍。利用立體定向技術(shù)建立的腦膠質(zhì)瘤原位模型，無(wú)論在動(dòng)物成活率，還是在成瘤率上都明顯優(yōu)于徒手移植法。立體定向移植法雖然優(yōu)點(diǎn)為操作穩(wěn)定、創(chuàng)傷較小、定位準(zhǔn)確、成瘤率高，但也有一些缺點(diǎn)：一是立體定向儀價(jià)格昂貴，操作技術(shù)要求高，不易普及；二是顱內(nèi)空間有限，接種細(xì)胞量、注射速度受顱內(nèi)壓增高的限制，導(dǎo)致操作時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，建立條件相同的同一批模型數(shù)量有限，這些因素在一定程度上制約了立體定向技術(shù)的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著科技不斷的發(fā)展，立體定向儀的不斷更新，接種技術(shù)的不斷完善，使立體定向儀建模速度加快，建立的模型更加穩(wěn)定可靠, 原位移植成瘤率已提高到90%～100%[19]，充分滿足了腦膠質(zhì)瘤研究方面的需求。

綜上所述，不同的膠質(zhì)瘤模型為腦膠質(zhì)瘤不同方面的研究都提供了可靠的平臺(tái)。但任何一種模型都不是非常完美，都存在某些方面的缺陷。這就要求我們?cè)谘芯恐校鶕?jù)腫瘤細(xì)胞來(lái)源、研究的性質(zhì)、各模型的特點(diǎn)等多方面因素，來(lái)選擇建立不同的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，這樣才能提高腫瘤研究的價(jià)值。隨著模型技術(shù)的發(fā)展，各種動(dòng)物模型的不斷完善，將會(huì)研制出更多功能完善、建模方便的動(dòng)物模型，這些模型的建立將為人腦膠質(zhì)瘤的研究發(fā)揮重要的作用。