乳粉中糖類的色譜及質(zhì)譜檢測方法研究進展

李 莉，薛偉鋒*，曹文軍

（1.大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116600；2.大窯灣海關(guān)技術(shù)中心，遼寧 大連 116600；3.中檢（大連）測試技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116600）

糖類作為乳粉中一類重要的營養(yǎng)成分，對人體起著至關(guān)重要的作用，如乳糖經(jīng)乳糖酶作用后轉(zhuǎn)化為有機酸，能夠有效促進鈣離子的吸收。另外，腸道健康也得益于乳糖對有益菌生長的促進作用。但有時乳糖也會起到反作用，如乳糖對某些體內(nèi)缺乏乳糖酶的乳糖不耐受者危害很大，由于乳糖消化吸收功能受阻，乳糖不耐受者可能出現(xiàn)腹瀉和腹痛等癥狀[1]。蔗糖雖然可以提高乳粉含糖量，但過量食用則會導(dǎo)致蛀牙和肥胖等。功能性低聚糖在嬰幼兒乳粉中作用顯著，不僅能促進嬰幼兒腸道有益菌群繁殖，還能增強免疫力，提高腸道防御功能，預(yù)防感染性腹瀉，改善功能性便秘[2-7]。國家標準也對嬰幼兒食品中功能性糖類物質(zhì)的添加量進行了規(guī)定，如GB 14880—2012《食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑使用標準》[8]規(guī)定，作為營養(yǎng)強化劑添加到嬰幼兒配方食品中的功能性糖類物質(zhì)總含量不得超過64.5 g/kg。盡管添加低聚糖的嬰幼兒配方乳粉是乳粉行業(yè)的一大亮點，但也存在低聚糖添加量極少的尖銳問題。因此，建立乳粉中糖類的檢測方法至關(guān)重要，掌握乳粉中糖含量對于了解乳粉品質(zhì)和指導(dǎo)消費者具有重要意義。

目前，糖類的分析方法主要有酶解法[9]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[10-11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-13]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[14-16]和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法等[17-19]。色譜及質(zhì)譜分析方法已經(jīng)成為糖類檢測的最主要手段，本文在總結(jié)已有研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合近年研究動態(tài)，綜述乳粉中糖類檢測的色譜及質(zhì)譜分析方法研究進展，方便科研人員選擇合適的糖類檢測方法。

嬰幼兒乳粉基質(zhì)復(fù)雜，所含糖種類多且含量差異大，因此對分離條件要求較高。盡管GC和GC-MS法對糖類的分析靈敏度較高且分離效果好，但存在樣品前處理步驟復(fù)雜的問題，尤其是對某些分析物需進行衍生化反應(yīng)。HPLC法受到檢測器的影響，對糖類的分析靈敏度相對較低。結(jié)合優(yōu)化的梯度洗脫程序的IC-電化學(xué)檢測法[20-21]在糖類分析中表現(xiàn)出分離效果好、靈敏度高和選擇性強等特點[22-23]，已被美國分析化學(xué)家協(xié)會等機構(gòu)廣泛應(yīng)用于食品分析檢測中[24]。針對復(fù)雜的乳粉樣品基質(zhì)，高分辨質(zhì)譜在靈敏度和抗干擾能力方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，成為未來乳粉中糖類檢測方法的重要發(fā)展趨勢[17-19]。本文針對上述幾種方法重點闡述乳粉中糖類檢測方法的研究進展。

1 GC法

孫曼澤等[25]采用GC法測定乳粉中的乳糖和蔗糖，測定乳糖的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為4.52%，回收率為94%～104%，測定蔗糖的RSD為4.35%，回收率為97.7%～102.3%；另外，根據(jù)GB 5413—1985《乳粉檢驗方法》[26]中的方法測得乳粉中的乳糖含量為30.5%，蔗糖含量為19.6%，2 種方法的相對誤差分別為0.66%和1.50%，表明用GC法測定乳粉中的乳糖和蔗糖操作簡便、分析速度快、準確度高，可以作為乳粉中乳糖和蔗糖含量的測定方法。但GC法需要對樣品進行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)條件較為苛刻。Block等[27]采用GC法測定11 批脫脂牛乳中異構(gòu)化乳糖的含量，結(jié)果表明，GC法對于脫脂乳中異構(gòu)化乳糖的檢測限為50 mg/L。Montilla等[28]利用對位取代苯酚氧苷作為內(nèi)標，建立乳制品中異構(gòu)化乳糖含量的GC測定法，并采用該方法檢測27 份商業(yè)牛乳樣品，回收率為89.6%～110.6%。

2 HPLC法

HPLC是糖類檢測的重要手段，在對樣品進行前處理后，選取不同的色譜柱和流動相，通過示差折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器對糖類進行分析。例如，黃紅霞[29]應(yīng)用HPLC對乳粉及調(diào)制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖進行測定，將樣品經(jīng)簡單的前處理后由碳水化合物分析柱分離，以乙腈/水為流動相，采用示差折光檢測器進行檢測，結(jié)果表明，乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖能夠完全分離，回收率為100.4%～106.1%，RSD＜0.9%，線性相關(guān)系數(shù)（R2）在0.998 3以上，證明該方法能夠簡便、快速測定乳粉及調(diào)制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖。吳莉等[30]使用HPLC對乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖進行測定時發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)簡單的預(yù)處理后，采用Spherisorb NH2色譜柱（0.46 cm×25 cm，7 μm）分離，以乙腈/水（體積比7∶3）為流動相，流速1 mL/min，采用示差折光檢測器檢測，3 種糖類能夠完全分離并定量，R2達0.999，回收率為99.98%～105.10%，RSD＜0.6%，證明采用HPLC法能夠?qū)θ榉壑械娜樘?、蔗糖和葡萄糖進行快速、準確測定，方法簡單易行。郭秀春等[31]選用市售同種品牌不同年齡段的乳粉，通過HPLC-示差折光檢測器法對其乳糖和蔗糖含量進行測定，結(jié)果表明，蔗糖和乳糖的線性范圍均為2～12 mg/mL，R2分別為0.999 3和0.999 6，RSD分別為2.53%和3.81%，平均加樣回收率分別為99.70%和101.06%，該方法測定結(jié)果準確、分析時間短、前處理簡單，適用于快速測定乳粉中的蔗糖和乳糖含量。Wang Xinmin等[32]建立了一種HPLC-示差折光檢測器分析配方乳粉中氨基葡萄糖和乳糖的簡單方法，樣品在進行HPLC分析前經(jīng)過蛋白質(zhì)沉淀凈化，采用昭和電工Asahipak NH2P-50柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，流動相為乙腈 -水（體積比7∶3），結(jié)果表明，該方法具有很好的線性（R2均大于0.99）、靈敏度（檢出限分別為0.11、0.13 mg/mL，定量限分別為0.21、0.23 mg/mL）、精密度（RSD分別為1.26%和1.06%）和回收率（分別為96.5%～98.2%和97.1%～98.0%），整個分離過程在10 min內(nèi)即可完成，該方法可以達到快速、簡便檢測乳粉中糖類的目的。

那紅萍等[33]采用HPLC法，以資生堂UG80S5柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為分析柱，示差折光檢測器檢測，1 次進樣同時測定乳粉低聚果糖中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，結(jié)果表明，3 種糖的回收率為98.8%～105.9%，RSD為0.20%～0.26%，最低檢出限為微克級。陳小英等[34]采用HPLC法同時測定乳粉中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，采用Agilent NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈 -水（體積比7∶3），示差折光檢測器檢測，結(jié)果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖質(zhì)量濃度分別在0.305 0～6.100 0、0.405 4～8.108 0、0.245 7～4.914 0 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，R2均在0.999 5以上，3 種物質(zhì)的加樣回收率平均值分別為96.1%、100.3%和100.0%，RSD分別為1.5%、2.9%和3.3%，該方法簡便、準確、可靠，適用于乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖3 種主要有效成分的測定。許彬等[35]采用HPLC法檢測乳粉中的低聚果糖，樣品經(jīng)硫酸銅（質(zhì)量濃度100 g/L）和氫氧化鈉（質(zhì)量濃度40 g/L）去除蛋白后，采用氨基色譜柱分離，示差折光檢測器分析，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，流動相為乙腈/水（體積比7∶3），外標法定量，結(jié)果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，添加回收率分別為99.1%、99.7%和95.3%，RSD分別為0.3%、1.1%和0.3%，檢出限分別為2、2、4 mg/kg，該方法快速靈敏、簡便、準確，適用于乳粉中低聚果糖的檢測。

Chávez-Serv?n等[36]建立一種HPLC-示差折光檢測器定性和定量分析配方乳粉中游離單糖和二糖（包括果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳果糖和乳糖）的簡單方法，結(jié)果表明，該方法具有很好的線性擬合系數(shù)（R2＞0.99），6 種糖的檢測限分別為0.17、0.13、0.06、0.16、0.05、0.25 mg/mL，定量限分別為0.27、0.24、0.20、0.26、0.22、0.38 mg/mL，果糖、蔗糖、乳果糖和乳糖的RSD分別為0.78%、0.99%、2.91%和0.46%，6 種糖的回收率為93%～113%。

除了HPLC-示差折光檢測器外，HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器也常用于乳粉中糖類的檢測。例如，趙敏等[37]建立了一種同時測定嬰幼兒配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用技術(shù)，采用氨基柱分離，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，結(jié)果表明，6 種功能性低聚糖得到很好分離，回收率為91.8%～102.0%，RSD＜3%（n=6），該方法能快速、準確、可靠地檢測嬰幼兒配方乳粉中功能性低聚糖的含量。孫久玉等[38]使用蒸發(fā)光散射檢測器測定配方乳粉中低聚果糖的含量，樣品用體積分數(shù)75%乙醇水溶液提取，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑置換成50%乙腈水溶液，并通過C18固相萃取柱除去樣品中多余的脂肪類物質(zhì)，進一步凈化樣品，采用Waters UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相采用乙腈和水，進行梯度洗脫，結(jié)果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的檢出限均為20 mg/100 g，回收率在88.5%以上，RSD均小于1.5%，完全能夠滿足配方乳粉中低聚果糖的檢測要求。

3 IC法

采用IC法測定糖類已有較多報道，如測定蜂蜜和葡萄酒[39]、蜂蜜和蜂膠[40]以及茶葉[41]中的糖等。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法[42-44]是近年來發(fā)展起來的一種測定糖類的有效方法，該方法具有前處理簡單、分離效果好和操作簡便等優(yōu)點[45]，已被用于牛乳和乳制品中單糖和二糖的測定[46]。利用IC法同時測定乳粉中的多種糖類已經(jīng)成為一種趨勢。

張水鋒等[47]建立梯度洗脫-IC-脈沖安培檢測技術(shù)，分析嬰幼兒配方乳粉中半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖5 種與代謝疾病緊密相關(guān)的糖類。該方法對樣品的前處理、色譜柱、淋洗液梯度等色譜條件進行優(yōu)化，重點研究淋洗液梯度對各組分分離效果的影響；將梯度洗脫程序分解為弱保留組分分離、乳糖分離、基質(zhì)消除、系統(tǒng)平衡4 個子程序，并分別對其進行條件優(yōu)化，實現(xiàn)了5 種組分的完全分離，并有效解決了弱保留組分色譜峰易重疊、乳糖色譜峰易拖尾等現(xiàn)象；5 種組分的線性范圍為0.5～100.0 mg/L，R2＞0.9 9，方法檢出限為0.0 6～0.4 0 m g/L；該方法具有分離度好、靈敏度高等優(yōu)點，可滿足例行分析的要求，同時也為淋洗液的梯度優(yōu)化提供了可借鑒的方法。熊建飛等[48]建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定乳粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法，以METROSEP CARB1陰離子交換柱（4.0 m m×1 5 0 m m，5 μ m）為分離柱，37 mmol/L氫氧化鈉溶液為淋洗液，以檸檬酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑，結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖和乳糖的線性范圍分別為1～40、1～50、1～50 mg/L，R2分別為0.996 6、0.996 8和0.998 5，檢出限分別為0.014、0.091、0.083 mg/L，RSD為1.10%～4.96%，回收率為90.13%～104.83%，該方法分析時間短、前處理簡單，適用于快速測定乳粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖。

冉丹等[49]建立以電化學(xué)脈沖安培-IC法檢測嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）含量的方法。首先采用IC法檢測經(jīng)β-半乳糖苷酶酶解的原料糖漿試樣中GOS含量，再以測得GOS含量的同批次原料糖漿作為對照，檢測嬰幼兒配方乳粉中GOS含量。通過對儀器色譜條件及前處理方法進行比較優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該方法線性關(guān)系良好，R2為0.999 7，RSD為3.5%，加標回收率為87.7%～92.4%。張志國等[50]建立指紋圖譜法測定嬰幼兒配方乳粉中GOS含量的方法，利用IC構(gòu)建GOS指紋圖譜，分析得到特征組分，進而測定嬰幼兒配方乳粉中GOS含量，結(jié)果表明，當稱樣量為1.0 g時，GOS檢出限為2.5 g/kg，定量限為5.0 g/kg，線性范圍為4.0～64.5 g/kg，回收率為94.0%～106.7%，RSD為1.2%～2.8%，表明指紋圖譜法的準確度和精密度滿足嬰幼兒配方乳粉中GOS含量測定的需要。

朱偉等[51]建立了一種同時測定嬰幼兒配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的高效離子色譜檢測技術(shù)，采用CarboPac PA20色譜柱（3.0 mm×150 mm，6.5 μm）分離，以氫氧化鈉-乙酸鈉為流動相，進行梯度洗脫，使用脈沖安培檢測器進行檢測。結(jié)果表明，8 種功能性低聚糖得到很好分離，回收率為80.0%～103.0%，RSD＜3%（n=6）。該方法能快速、準確、可靠地檢測嬰幼兒配方乳粉中功能性低聚糖的含量。

Cataldi等[46]建立一種簡單、靈敏的用于分離和定量乳粉中單糖和二糖的液相色譜方法，經(jīng)凈化和適當稀釋后測定樣品中乳糖、半乳糖、葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖含量，分離過程在高效陰離子交換色譜儀（配備脈沖電流檢測器）中完成，以金作為電極，乙酸鋇的堿溶液（含10 mmol/L氫氧化鈉和1 mmol/L乙酸鋇）作為流動相，根據(jù)樣品的不同，考慮最佳分離效果選取洗脫液，確保沒有基質(zhì)效應(yīng)影響。結(jié)果表明，該方法具有良好的靈敏度和準確度，可以用于牛乳、干酪等乳制品中單糖和二糖的檢測。

4 LC-MS法

除了GC、GC-MS、HPLC和IC外，液相色譜-質(zhì)譜法也被用來分析乳粉中糖類。劉蕓等[17]建立高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜測定乳粉中低聚果糖的方法，采用碳水化合物分析柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）進行分離，以乙腈與0.1%乙酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，質(zhì)譜采用正離子模式，結(jié)果表明，該方法對蔗果三糖和蔗果四糖的檢出限可達100 μg/kg，對蔗果五糖的檢出限可達55 μg/kg，加標回收實驗結(jié)果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的平均回收率為75.8%～107.3%，RSD為1.6%～8.3%。甄振鵬等[18]建立乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的HPLC-MS/MS檢測方法，采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈-氨水溶液為流動相進行洗脫，選擇電噴霧質(zhì)譜負離子源，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進行測定，結(jié)果表明，該方法對蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的檢出限分別為0.032、0.022、0.039、0.054 mg/kg，回收率為90.8%～95.8%，RSD為3.6%～9.0%（n=6）。甄振鵬等[19]還建立了測定乳粉中棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的HPLC-MS/MS方法，同樣采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈-水溶液為流動相進行洗脫，選擇電噴霧離子源負離子模式，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進行測定，結(jié)果表明，該方法對棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的檢出限分別為13.4、7.7、11.1 μg/kg，回收率為80.8%～86.6%，RSD為3.0%～8.0%（n=6）。

5 結(jié) 語

對于沒有紫外吸收的低聚糖類，通常采用HPLC-示差折光檢測器法、HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器法和IC法測定。示差折光檢測器法存在系統(tǒng)平衡時間長、分析過程需要恒溫且無法梯度洗脫的問題，另外，該方法檢測靈敏度低，對于低聚果糖含量0.5%～2.0%的添加益生元的食品非常不適用。HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器法和IC法克服了示差折光檢測器方法的不足，雖然靈敏度有所提高，但對于含有單糖和雙糖的乳粉中低聚果糖的測定效果很差，從而影響了低聚果糖的準確定量。為了能夠良好分離簡單基質(zhì)樣品中的低聚果糖，需要花費分析時間。IC法和蒸發(fā)光散射檢測器法在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品時存在前處理過程復(fù)雜和定量結(jié)果偏差大等不足。對于以上問題，考慮到乳粉樣品基質(zhì)較復(fù)雜，充分利用高分辨質(zhì)譜在靈敏度和抗干擾能力方面的優(yōu)勢，建立前處理過程簡便、分析時間短、測定結(jié)果準確的方法成為未來乳粉中糖類檢測的重要發(fā)展趨勢。