原料乳中嗜冷菌快速檢測與控制技術(shù)研究進展

洪 青，李 楠，劉振民

（光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海 200436）

嗜冷菌是一類能在7 ℃以下生長、20 ℃以下繁殖的細菌。原料乳中常見的嗜冷菌包括革蘭氏陽性菌（芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬和李斯特菌屬等）和革蘭氏陰性菌（假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和黃桿菌屬）以及一部分酵母菌和霉菌等[1]。與嗜溫微生物細胞膜組成相比，嗜冷菌細胞膜中含有大量的直鏈和支鏈不飽和脂肪酸，由于脂肪熔點低的緣故，即使在較低溫度下細胞膜仍能保持較強的流動性，吸收外來營養(yǎng)物質(zhì)，用于菌體生長繁殖[2]。此外，參與新陳代謝的酶所需活化能較低，催化效率較高[3-4]，同時胞內(nèi)存在冷激蛋白，這些均有利于嗜冷菌在低溫條件下生長[5-6]。

1 原料乳中嗜冷菌的來源與危害

原料乳中嗜冷菌的污染主要為外源污染，包括源頭污染和加工時的二次污染。嗜冷菌來源廣泛，其在低溫條件下能夠生長，繁殖溫度要求不高，因此未經(jīng)處理的原料乳、不潔凈的擠奶和貯藏設(shè)備、不合規(guī)衛(wèi)生操作環(huán)境等均會帶來大量嗜冷菌污染。

嗜冷菌污染的危害主要表現(xiàn)在嗜冷菌在原料乳貯藏期間會產(chǎn)生具有熱穩(wěn)定性的胞外蛋白酶、脂肪酶和堿性磷酸脂酶等，這些酶是影響產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。蛋白酶和脂肪酶可持續(xù)水解乳蛋白和乳脂肪，生成苦味肽、氨基酸和脂肪酸等，引發(fā)凝結(jié)、蛋白質(zhì)分層、風味、口感變差等品質(zhì)問題。實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，原料乳經(jīng)巴氏殺菌后，嗜冷菌全部死亡，但產(chǎn)生的耐熱蛋白酶和脂肪酶能夠保持部分活性，甚至經(jīng)過超高溫加熱處理后部分酶仍有活性，最終導致牛乳變質(zhì)，影響乳品風味、質(zhì)地及感官等品質(zhì)[7]。

Yuan Lei等[8]發(fā)現(xiàn)，假單胞菌、沙雷氏菌和金黃桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力較強，耶爾森氏菌所產(chǎn)蛋白酶的活力最高，不動桿菌產(chǎn)脂肪酶的能力較強。大量的蛋白酶及脂肪酶即使經(jīng)高溫熱處理后仍有活性殘留，熱滅活動力學參數(shù)證實，經(jīng)常規(guī)方法滅菌后，殘留的蛋白酶仍對乳制品品質(zhì)及貨架期有潛在危害。Hantsis-Zacharov等[9]發(fā)現(xiàn)，絕大部分嗜冷菌能夠產(chǎn)生脂肪酶或同時產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，僅產(chǎn)蛋白酶的微生物很少，如假單胞菌屬和不動桿菌屬能夠產(chǎn)生具有高活性的脂酶，細桿菌屬能夠產(chǎn)生具有高活性的蛋白酶和脂肪酶。

2 不同地區(qū)原料乳中嗜冷菌的菌群組成

嗜冷菌是影響乳及乳制品品質(zhì)優(yōu)劣的重要因素，原料乳從擠奶到加工前需保持低溫條件運輸和貯藏，由于嗜冷菌能分泌蛋白酶和脂肪酶等，因此低溫條件下也能導致生鮮乳變質(zhì)，我國現(xiàn)行的GB 19301—2010《食品安全國家標準 生乳》僅對菌落總數(shù)做了限量規(guī)定（2×106CFU/mL），沒有針對嗜冷菌的限量指標。在乳品企業(yè)實際生產(chǎn)中，根據(jù)原料乳品質(zhì)等級，嗜冷菌限量值一般保持在103～105CFU/mL以下。

雷鳴等[10]研究表明，原料乳微生物中的擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）豐度最高，擬桿菌門主要為黃桿菌屬（相對豐度47.66%）和金黃桿菌屬，變形菌門包括假單胞菌屬（相對豐度39.54%）、不動桿菌屬（相對豐度3.77%）、嗜冷桿菌屬（相對豐度0.55%）、醋酸桿菌屬和摩根氏菌屬；4 ℃條件下貯藏24 h，原料乳中菌落總數(shù)為（1.5～1.8）×105CFU/mL，嗜冷菌數(shù)為（1.0～1.3）×105CFU/mL，1 0 ℃條件下貯藏2 4 h，原料乳中嗜冷菌數(shù)為106CFU/mL。15 ℃條件下貯藏24 h，嗜冷菌數(shù)超過2×106CFU/mL。北京地區(qū)原料乳中乳酸乳球菌占比較高，生物多樣性較低；北京、哈爾濱和黑河3 個地區(qū)原料乳中的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬和假單胞菌屬，包括假單胞菌、不動桿菌、乳桿菌、鏈球菌和腸球菌；3 個地區(qū)原料乳中均發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，可能由儲奶罐、原料乳運輸管道和罐裝機器引入；該研究還發(fā)現(xiàn)，相同貯藏條件下，同一地區(qū)的原料乳相似度高于同一貯藏時間的原料乳[11]。

Li Nan等[12]研究表明，上海地區(qū)6月份原料乳的細菌生物多樣性最高，12月份最低，所含嗜冷菌主要為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，假單胞菌屬、乳桿菌屬和不動桿菌屬相對豐度最高，低溫貯藏時原料乳中假單胞菌屬、丙酸菌屬和黃桿菌屬相對豐度較高，假單胞菌/丙酸菌、乳桿菌/雙歧桿菌分別具有協(xié)同效應；丙酸菌屬和假交替單胞菌屬與菌落總數(shù)呈負相關(guān)，有助于監(jiān)控原料乳質(zhì)量；溫度和濕度是影響原料乳微生物菌群變化的決定性因素，溫度較低的季節(jié)放線菌門相對豐度較高，溫度較高的季節(jié)厚壁菌門相對豐度較高，濕度較低的季節(jié)擬桿菌門相對豐度較高，濕度較高的季節(jié)變形菌門相對豐度較高。浙江地區(qū)原料乳中分離得到假單胞菌、類黃假單胞菌、熒光假單胞菌和乳酸菌等種屬，其中假單胞菌屬菌株有13 株，為嗜冷菌中的優(yōu)勢菌群[13]。

國外原料乳的菌落組成也各不相同，巴西巴拉那牧場原料乳中分離的嗜冷菌中，產(chǎn)蛋白酶的嗜冷菌包括乳酸乳球菌（27.3%）、神戶腸桿菌（14.8%）、解脲沙雷氏菌（8.0%）、馬脲氣球菌（6.8%）和地衣芽孢桿菌（6.8%）；產(chǎn)脂肪酶的嗜冷菌包括神戶腸桿菌（17.7%）、乳酸乳球菌（15.6%）、馬脲氣球菌（12.5%）和魯氏不動桿菌（9.4%），菌落總數(shù)平均值為1.5×105CFU/mL，嗜冷菌數(shù)平均值為1.1×104CFU/mL，占比78.3%[14]。Ercolini等[15]從意大利牧場原料乳中分離得到66 株菌，假單胞菌和腸桿菌是最常見的嗜冷菌，50%革蘭氏陰性菌和65%假單胞菌能在5 ℃條件下生長，13 株革蘭氏陰性菌（主要為假單胞菌）所產(chǎn)蛋白酶在7 、20 ℃條件下均有活力；菌落總數(shù)為5.0×103～6.0×105CFU/mL，嗜冷菌總數(shù)為1.2×103～1.6×105CFU/mL。Hantsis-Zacharov等[9]發(fā)現(xiàn)，法國牧場原料乳中優(yōu)勢菌群（假單胞菌屬、不動桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬和細桿菌屬）在4 個季節(jié)均存在，其中春季和冬季優(yōu)勢菌群為丙型變形菌綱，夏季優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌綱，秋季優(yōu)勢菌群為放線菌綱，全年菌落總數(shù)平均值為（4.8±2.3）×104CFU/mL，嗜冷菌數(shù)平均值為7×103CFU/mL，占比（14.7±6.4）%。以上研究表明，地區(qū)、季節(jié)和濕度對原料乳中嗜冷菌的組成和數(shù)量具有顯著影響。

3 原料乳中嗜冷菌的快速檢測技術(shù)

乳及乳制品中嗜冷菌的菌落總數(shù)標準測定方法為NY/T 1331—2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》中的MPC平板計數(shù)法，乳樣于6.5 ℃條件下培養(yǎng)10 d，該法計數(shù)結(jié)果準確，但實驗周期長，無法在實際工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用。目前，國內(nèi)外開發(fā)出基于微生物學、化學、生物化學等的原料乳中微生物快速檢測方法，包括直接檢測法（直接熒光過濾法、流式細胞術(shù)和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法等）和間接檢測法（脂肪酶法、氨肽酶法和酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法等），各方法優(yōu)劣不一。國內(nèi)乳品企業(yè)一般利用微生物檢測儀或流式細胞儀對原料乳中的微生物進行快速測定，但尚未有合理、便捷、快速、廉價的方法測定原料乳中的蛋白酶和脂肪酶等。

原料乳中嗜冷菌的快速檢測包括直接檢測法和間接檢測法，其中直接檢測法包括流式細胞術(shù)、直接熒光過濾法、實時熒光定量PCR、熒光原位雜交技術(shù)及等溫擴增技術(shù)等，間接檢測法包括游離脂肪酸測定、氨肽酶活性測定、ELISA及電阻抗法等。此外，低溫貯藏條件下原料乳中的嗜冷菌數(shù)與菌落總數(shù)呈一定線性關(guān)系，因此可以利用現(xiàn)有的原料乳中菌落總數(shù)快速測定方法，基于數(shù)學模型構(gòu)建原料乳中嗜冷菌數(shù)的快速預測方法，評估原料乳污染情況[16-17]。多種快速檢測方法在原料乳嗜冷菌和菌落總數(shù)檢測中的應用如表1所示，包括檢測時間、檢測限、檢測相關(guān)系數(shù)、優(yōu)勢和不足。

表1 原料乳中嗜冷菌和菌落總數(shù)快速檢測方法Table 1Comparative evaluation of rapid detection methods for psychrophilic bacterial and total bacterial counts in raw milk

4 原料乳中嗜冷菌的控制技術(shù)

嗜冷菌控制技術(shù)通常覆蓋乳制品全產(chǎn)業(yè)鏈，包括乳源、加工、冷鏈物流和銷售等環(huán)節(jié)，因此乳品企業(yè)的控制手段通常包括干凈衛(wèi)生的生產(chǎn)環(huán)境、標準規(guī)范的擠奶操作、清洗消毒擠奶設(shè)備、定期檢查容器衛(wèi)生、完善的冷鏈和實驗室質(zhì)量管理監(jiān)控等。工業(yè)化生產(chǎn)常采用低溫殺菌法進行預殺菌，以保證原料乳質(zhì)量，目前隨著優(yōu)質(zhì)乳工程的開展，部分乳品企業(yè)的優(yōu)質(zhì)乳源可直接低溫貯藏，不需要進行預殺菌處理。當貯藏溫度為4 ℃左右時，嗜冷菌表現(xiàn)出較長的延滯期與代時。雷鳴等[10]利用16S rRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)，4 ℃冷藏1 d后，原料乳中的嗜冷菌相對含量超過90%，嗜冷菌成為原料乳中的優(yōu)勢菌，低溫貯藏條件為4 ℃（≤24 h）、10 ℃（≤16 h）、15 ℃（≤8 h）時，原料乳中的菌落總數(shù)能滿足生乳的食品安全國家標準，嗜冷菌不會大量增殖。

國外對生鮮乳中嗜冷菌的源頭防控措施研究較早，美國食品藥品管理局頒布了“A”級巴氏殺菌乳條例，建立了包括乳的取樣、搬運和運輸、奶場建造、乳品生產(chǎn)標準、水源標準、人員清潔、設(shè)備裝置測試和農(nóng)產(chǎn)監(jiān)管等在內(nèi)的整體質(zhì)量體系[30]。同時，國外乳業(yè)還開發(fā)利用超聲波、脈沖電場、超高壓均質(zhì)、膜過濾及超臨界二氧化碳等非熱處理技術(shù)，降低乳中微生物、蛋白酶及脂肪酶活力，保障提升乳制品品質(zhì)標準[31-32]。與常規(guī)的加熱滅菌技術(shù)相比，高壓處理技術(shù)可以提高乳品的微生物安全性，延長其貨架期[33]，25 ℃、450 MPa超高壓處理20 min，莓實假單胞菌活菌數(shù)降低，蛋白酶活力降低14%，溫度提高至50 ℃，酶活力降低40%[34]。

微生物溯源是通過比較目標樣品與可能污染源中微生物的差異以確定污染源，生態(tài)環(huán)境的變化和外來物種的引進加速了菌種變異，導致新的病原微生物出現(xiàn)，其傳播途徑和機會也在擴大。美國和歐盟等已開展相關(guān)研究工作，我國還處于起步階段。原料乳中嗜冷菌污染的溯源需要對乳樣、牛乳房、擠奶裝置、輸送管道、奶罐、飼料等整個原料乳生產(chǎn)鏈進行采樣，將全部微生物進行培養(yǎng)、篩選和測序分析，建立表型和基因型數(shù)據(jù)庫[35]。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法和表型分析法每次只能確定1 種微生物，費時費力，難以實現(xiàn)快速測定。伴隨分子生物學和測序技術(shù)的發(fā)展，基因分型方法以其靈敏度高、特異性強和分型率佳等優(yōu)點逐漸代替表型分型技術(shù)，如核糖體分析、隨機擴增多態(tài)性分析、重復序列擴增分析、脈沖場凝膠電泳分析和基于全基因組測序的單核苷酸多態(tài)性分析等技術(shù)[36]。目前這些技術(shù)仍有不足之處，如隨機擴增多態(tài)性分析受引物和反應條件影響、核糖體分型設(shè)備要求高、脈沖場凝膠電泳技術(shù)要求高且耗時等。隨著測序成本的大幅降低以及微生物序列比對數(shù)據(jù)庫和測序數(shù)據(jù)軟件的日趨完善，在開發(fā)建立嗜冷菌快速檢測方法的基礎(chǔ)上，溯源網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建能夠?qū)θ榧叭橹破返钠焚|(zhì)保障提供有力支撐。

5 結(jié) 語

嗜冷菌多樣性污染是影響乳及乳制品質(zhì)量安全的關(guān)鍵因素，建立開發(fā)精準、便捷的嗜冷菌檢測方法是有效制定嗜冷菌污染解決措施的必要前提。目前的嗜冷菌快速檢測方法在實驗室階段效果良好，但由于操作復雜、成本高或特異性不強等原因，部分方法無法在實際生產(chǎn)中進行規(guī)?；瘧谩ｋS著分子生物學的發(fā)展，建立完善嗜冷菌數(shù)據(jù)庫、基于分子分型、代謝物指紋圖譜等方法建立種水平甚至亞種水平上的嗜冷菌鑒別和溯源技術(shù)是未來乳品安全研究的重要方向，能夠為乳制品全產(chǎn)業(yè)鏈的品質(zhì)保障提供技術(shù)支撐。