H19和E2F1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義

薛玲玲，馬會(huì)峰

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院1婦科，2產(chǎn)科，河南 洛陽 471000

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carinoma，EC）是臨床常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率較高，以圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性多見[1]。EC的發(fā)病部位較隱匿，早期癥狀不明顯，大部分患者確診時(shí)已為中晚期。手術(shù)治療能夠提高早期EC患者的遠(yuǎn)期生存率，但其對(duì)于大部分中晚期EC患者特別是發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中晚期EC患者的效果較差，患者復(fù)發(fā)率高，預(yù)后不良。因此，尋找EC的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)是提高EC患者生存率的關(guān)鍵[2-3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200個(gè)核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA片段，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學(xué)過程。H19屬于lncRNA，lncRNAH19在不同腫瘤中通過不同的途徑發(fā)揮著致癌基因或抑癌基因的作用。E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）是由人類E2F1基因編碼的蛋白質(zhì)，是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，在多種惡性腫瘤中均過表達(dá)[4-5]。目前，關(guān)于H19與E2F1在EC患者EC組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性的研究較少。本研究探討H19和E2F1在EC患者EC組織中的表達(dá)情況及臨床意義，旨在為EC的早期診治提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年3月至2013年3月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院的64例EC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)子宮內(nèi)膜癌；②術(shù)前未接受過放療及化療等抗腫瘤治療；③國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期[6]為Ⅰ～Ⅳ期；④依從性良好；⑤擬接受手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜20歲；②近期服用過激素類藥物；③合并其他子宮疾??；④合并其他部位惡性腫瘤；⑤合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫系統(tǒng)疾病；⑥合并嚴(yán)重的心、肺、腎等其他臟器功能障礙；⑦合并精神類疾病和認(rèn)知功能障礙。64例EC患者的年齡為35～78歲，平均年齡為（54.36±4.18）歲；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期24例；分化程度：高分化17例，中分化35例，低分化12例；組織學(xué)分級(jí)：G1級(jí)31例，G2級(jí)20例，G3級(jí)13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有研究對(duì)象及家屬均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。收集64例EC患者術(shù)中切除的EC組織及相應(yīng)的癌旁組織石蠟標(biāo)本，用無菌焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水洗去血液，置入去RNA酶離心管中，液氮中保存?zhèn)溆?。將所有樣品快速冷凍于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara公司，E2F1鼠抗人單克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）及免疫組化SP顯色試劑盒均由上?？泼羯锟萍加邢薰咎峁?500 FAST型qRT-PCR儀購自美國ABI公司，MyCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司，紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司。引物由上海Genepharma公司合成。

1.3 H19和E2F1相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取50 mg組織樣本于液氮中研磨成粉末，迅速置于1.5 ml離心管中，加入100 ml Trizol試劑，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟從EC及癌旁組織中提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度，在260 nm和280 nm處測(cè)量吸光度值，計(jì)算兩者的比值，兩者比值為1.8～2.0方可用于合成cDNA。所有操作按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。冰浴中配制20μl反應(yīng)體系，包括5×Primer Script Buffer 4 μl，反應(yīng)液10 μl，Primer Script RT Enzyme Mix 1 μl，RT Primer 2 μl，RNase-free ddH2O 3 μl。反應(yīng)條件：95 ℃1 min，42 ℃15 min，85 ℃5 s；合成cDNA置于-20℃保持備用。PCR的總反應(yīng)體系為20 μl，包括 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μl，cDNA 2 μl，上游引物1.6 μl，下游引物1.6 μl，RNasefree ddH2O 4.8 μl。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，65℃3 s，60℃30 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-△△Ct公式計(jì)算EC組織及癌旁組織中H19和E2F1的相對(duì)表達(dá)量。H19的上游引物為5'-TGATGACGGGTGGAGGGGCTA-3'，下游引物為5'-TGATGTCGCCCTGTCTGCACG-3'；E2F1的上游引物為5'-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3'，下游引物為5'-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3'；內(nèi)參GAPDH的上游引物為5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 E2F1蛋白檢測(cè)

采用免疫組化SP法檢測(cè)EC組織及癌旁組織中E2F1蛋白的表達(dá)情況，用已知EC組織陽性切片作陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。E2F1蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色為陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度判斷染色結(jié)果。隨機(jī)選取高倍鏡（×200）下的10個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞所占比例≤10%為1分，10%＜陽性細(xì)胞所占比例≤50%為2分，50%＜陽性細(xì)胞所占比例≤80%為3分，80%＜陽性細(xì)胞所占比例≤100%為4分。染色強(qiáng)度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘為總分，總分≤4分為E2F1蛋白表達(dá)陰性，總分＞4分為E2F1蛋白表達(dá)陽性。

1.5 隨訪

采用電話隨訪的方式對(duì)所有EC患者隨訪5年，每個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2018年3月31日，記錄隨訪期間患者的生存情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中H19和E2F1相對(duì)表達(dá)量的比較

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，H19在EC組織中的相對(duì)表達(dá)量為（2.91±0.73），明顯高于癌旁組織的（1.32±0.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.360，P＜0.01）。E2F1在EC組織中的相對(duì)表達(dá)量為（1.73±0.49），明顯高于癌旁組織的（0.65±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.810，P＜0.01）。

2.2 不同組織中E2F1蛋白陽性表達(dá)情況的比較

免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)果顯示，E2F1蛋白在EC組織中的陽性表達(dá)率為67.19%（43/64），明顯高于癌旁組織的7.81%（5/64），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.133，P＜0.01）。（圖1）

圖1 免疫組化法檢測(cè)E2F1蛋白在EC 組織中的表達(dá)情況（SP染色，×200）

2.3 不同臨床特征EC患者EC組織中H19、E2F1表達(dá)情況的比較

以EC患者EC組織中H19相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（2.31）、E2F1相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（1.28）為臨界值，將64例EC患者分為H19高表達(dá)（H19相對(duì)表達(dá)量＞2.31）患者30例和H19低表達(dá)（H19相對(duì)表達(dá)量≤2.31）患者34例，E2F1高表達(dá)（E2F1相對(duì)表達(dá)量＞1.28）患者28例和E2F1低表達(dá)患者36例（E2F1相對(duì)表達(dá)量≤1.28）。不同年齡、分化程度、FIGO分期EC患者EC組織中H19的高表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況EC患者EC組織中H19的高表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.357、10.787，P＜0.05）。不同年齡EC患者EC組織中E2F1的高表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同F(xiàn)IGO分期、分化程度、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況EC患者EC組織中E2F1的高表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.486、7.156、7.591、17.578，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征EC患者EC組織中H19、E2F1的表達(dá)情況

2.4 EC組織中H19和E2F1表達(dá)的相關(guān)性分析

對(duì)EC患者EC組織中H19和E2F1表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，H19和E2F1在EC患者EC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.750，P＜0.01）。

2.5 H19、E2F1表達(dá)與EC患者預(yù)后的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，64例EC患者中，生存31例，死亡33例。H19高表達(dá)的EC患者的5年生存率為33.33%（10/30），低于H19低表達(dá)的EC患者的61.76%（21/34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.451，P=0.035）。E2F1高表達(dá)患者的5年生存率為32.14%（9/28），低于E2F1低表達(dá)患者的61.11%（22/36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.432，P=0.020）。

3 討論

EC是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率逐漸上升，術(shù)后復(fù)發(fā)率升高，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的健康與生命[7]。遺傳、絕經(jīng)情況、雌激素情況、病理學(xué)診斷和影像技術(shù)等多種因素與EC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]。因此，需要對(duì)EC的致病機(jī)制進(jìn)行深入的研究，以尋找新的預(yù)后標(biāo)志物為EC患者提供最佳的治療和隨訪。

lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要在表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾方面調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在多種腫瘤中均有表達(dá)，能夠通過上調(diào)或下調(diào)其在腫瘤組織中的表達(dá)，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用，該類基因可作為腫瘤生物標(biāo)志物[9]。多種lncRNA在EC的發(fā)生過程中均發(fā)揮著重要的作用，如HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是個(gè)已知的、通過反式作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)的lncRNA。王明娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在EC患者的EC組織中高表達(dá)，并與EC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均有關(guān)。lncRNAANRIL是lncRNA的一種，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著致癌基因的作用。殷悅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL在EC患者的EC組織中的相對(duì)表達(dá)量較高，且與EC的病理分級(jí)可能有關(guān)，可作為早期EC的輔助診斷指標(biāo)。H19是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤有關(guān)的lncRNA，具有促進(jìn)腫瘤生長和抑制腫瘤生長的雙重功能，在多種腫瘤尤其是在轉(zhuǎn)移性腫瘤中高表達(dá)，具有較強(qiáng)的致癌活性[12]。Zhu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RNA干擾后的H19可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，可能能夠作為卵巢癌治療的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，H19在EC組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），與Zhao等[14]的研究結(jié)果基本一致，提示H19在EC患者EC組織中的相對(duì)表達(dá)量較高，可能參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展。E2F1是細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族成員之一，且具有多種功能，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。王宏坤等[15]研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率較高，可作為乳腺癌預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。楊秀華和武昕[16]研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在外陰鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率較高，不同腫瘤分期外陰鱗狀細(xì)胞癌患者外陰鱗狀細(xì)胞癌組織中E2F1的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示E2F1可能參與外陰鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，E2F1在EC組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），與Mints等[17]的研究結(jié)果基本一致，提示EC患者組織中E2F1的表達(dá)上調(diào)。本研究進(jìn)一步分析了H19和E2F1的表達(dá)與EC患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，H19的高表達(dá)情況與EC患者的年齡、分化程度、FIGO分期可能無關(guān)，與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況可能有關(guān)；E2F1的高表達(dá)情況與EC患者的年齡可能無關(guān)，與EC患者的FIGO分期、分化程度、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況可能有關(guān)，提示H19、E2F1參與EC的發(fā)生與發(fā)展。另外，本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，EC患者EC組織中H19和E2F1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.750，P＜0.01），提示二者可能通過相互協(xié)同作用參與EC的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，H19能夠通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-29a-3p調(diào)節(jié)E2F1的表達(dá)，而且E2F1能夠通過調(diào)控下游靶基因p53突變體參與EC的發(fā)生，因此，H19和E2F1可能存在共同的信號(hào)通路，在參與EC的發(fā)生與發(fā)展過程中起著一定的協(xié)同作用[18-19]。本研究結(jié)果還顯示，H19和E2F1低表達(dá)的EC患者的生存情況分別優(yōu)于H19和E2F1高表達(dá)的EC患者（P＜0.05），提示H19、E2F1的表達(dá)與EC患者的預(yù)后有關(guān)，可作為評(píng)估EC預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，H19和E2F1在EC患者EC組織中的表達(dá)上調(diào)，可能與EC患者的某些臨床特征有關(guān)，且二者的表達(dá)水平呈正相關(guān)；此外，H19和E2F1高表達(dá)患者的預(yù)后較差。因此，H19和E2F1可能成為EC發(fā)生和預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。但本研究的不足之處在于納入的樣本量不足，因此，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步補(bǔ)充臨床資料、擴(kuò)大樣本量，深入研究H19和E2F1在EC中的作用，以進(jìn)一步闡明EC發(fā)生、發(fā)展的潛在分子機(jī)制。