LBC聯(lián)合BRAFV600E 基因檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值△

趙清泉，程思賢，許建華，鄭正榮

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院甲乳外科，福建泉州 362000

甲狀腺結(jié)節(jié)是臨床中常見疾病，全球發(fā)病率約4%～7%，其中4%～8%的甲狀腺結(jié)節(jié)為甲狀腺癌，甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，也是近年來中國發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，其病理類型中的60%為甲狀腺乳頭狀癌[2]。超聲引導(dǎo)下對甲狀腺結(jié)節(jié)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查（fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）是臨床診斷甲狀腺癌的首選方案，通常采用傳統(tǒng)涂片（coventional smear，CS）診斷甲狀腺結(jié)節(jié)[1]。但CS的涂片質(zhì)量較差，10%～40%的甲狀腺結(jié)節(jié)無法明確診斷及判別[3]。當(dāng)FNAC中選用液基細(xì)胞學(xué)（liquid-based cytology，LBC）技術(shù)制片，涂片質(zhì)量更優(yōu)，目前在臨床上也較為廣泛地使用。B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）最常見的突變是第600位密碼子突變（V600E），BRAFV600E基因突變也是甲狀腺癌常見的基因突變類型，在甲狀腺乳頭狀癌中占29%～84%，且與甲狀腺癌的侵襲程度密切相關(guān)[3]。有研究顯示，BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺癌實(shí)體瘤臨床診斷、良惡性鑒別診斷、預(yù)后評估方面有重要指導(dǎo)作用[4]。然而，目前臨床關(guān)于LBC聯(lián)合BRAFV600E基因突變鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的報(bào)道較少。因此，本研究采用LBC及BRAFV600E對甲狀腺乳頭狀癌及良性病變進(jìn)行鑒別診斷，旨在提高臨床診斷甲狀腺乳頭狀癌的準(zhǔn)確性，為臨床診治提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年12月至2017年11月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院已進(jìn)行手術(shù)治療的90例甲狀腺結(jié)節(jié)患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均行CS、LBC和BRAFV600E檢測，并且已經(jīng)手術(shù)切除甲狀腺結(jié)節(jié)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理結(jié)果顯示為非乳頭狀癌的甲狀腺惡性腫瘤患者。90例甲狀腺結(jié)節(jié)患者中，男性11例，女性79例，年齡13～67歲，平均（44.72±9.69）歲；腫物直徑 5.0～75.0 mm，平均（29.4±10.7）mm；病程1天～20年；28例為單發(fā)結(jié)節(jié)，62例為多發(fā)結(jié)節(jié)；超聲TI-RADS 4A～5類為58例，超聲TI-RADS 2～3類為32例。

1.2 檢測方法

所有患者術(shù)前均先行CS和LBC檢測，并同時(shí)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRTPCR）法進(jìn)行BRAFV600E基因檢測。

患者取仰臥位，肩部墊軟枕，頭后仰，常規(guī)碘伏消毒鋪巾，穿刺進(jìn)針點(diǎn)局部浸潤麻醉后，右手持一次性吸引活檢針，超聲引導(dǎo)下將細(xì)針穿入目標(biāo)結(jié)節(jié)，拔出針芯，穿刺針在結(jié)節(jié)內(nèi)沿不同方向前后快速穿插數(shù)次，通過虹吸原理吸取甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)胞，囊實(shí)性結(jié)節(jié)穿取實(shí)性部位細(xì)胞，穿刺標(biāo)本分別立即行CS、LBC和BRAFV600E基因檢測。穿刺標(biāo)本行CS后采用95%無水乙醇濕法固定，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色[5]，德國萊卡光學(xué)顯微鏡下行細(xì)胞學(xué)診斷。

穿刺標(biāo)本直接注入30 ml細(xì)胞保存液中，離心后去上清液，去除膠質(zhì)、黏液和血細(xì)胞成分，利用全自動液基細(xì)胞制片儀制片、封片和HE染色，德國萊卡光學(xué)顯微鏡下行細(xì)胞學(xué)診斷。

穿刺標(biāo)本注入含800 μl RNA later保存液的PCR管中以進(jìn)行BRAFV600E基因檢測。采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行DNA分離，提取樣本基因組DNA，然后通過qRT-PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法和BRAFV600E基因突變試劑盒進(jìn)行BRAFV600E基因檢測。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

所有患者檢測后均行手術(shù)治療，手術(shù)中切除的甲狀腺結(jié)節(jié)標(biāo)本均行組織病理學(xué)診斷，以組織病理學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。分析CS、LBC及BRAFV600E基因單獨(dú)檢測及LBC與BRAFV600E聯(lián)合檢測對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價(jià)值。根據(jù)甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)定義、標(biāo)準(zhǔn)和注釋[6]，將甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)診斷分為6類：Thyl，標(biāo)本無法診斷或不滿意；Thy2，良性，包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺增生、甲狀腺炎；Thy3，意義不明確的細(xì)胞非典型性病變，或意義不明確的濾泡性病變；Thy4，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Thy5，可疑惡性腫瘤；Thy6，惡性腫瘤。本研究將Thy2、Thy3和Thy4良性病變記為陰性，將Thy5、Thy6甲狀腺乳頭狀癌記為陽性。BRAFV600E突變型為陽性，BRAFV600E野生型為陰性。雙盲，由兩名高年資病理科醫(yī)師對病理學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行判定。靈敏度=真陽性例數(shù)（/真陽性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度=真陰性例數(shù)（/真陰性+假陽性）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 LBC與CS 檢測的甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)特點(diǎn)

90例患者，術(shù)后病理診斷結(jié)果顯示40例患者為甲狀腺乳頭狀癌，50例為良性病變（10例合并橋本甲狀腺炎）。

顯微鏡下，CS背景較為模糊，血液、膠質(zhì)及無定形物成分較多，濾泡細(xì)胞分布不集中、重疊堆積、出現(xiàn)多層排列現(xiàn)象，核溝、假包涵體、沙礫體等甲狀腺乳頭狀癌的特征性診斷結(jié)構(gòu)模糊難辨，制片過程中導(dǎo)致細(xì)胞變形及退變（圖1）。顯微鏡下，LBC視野更加清晰，血液、膠質(zhì)成分少，濾泡細(xì)胞集中且數(shù)量顯著增加，細(xì)胞呈單層小簇狀排列，惡性細(xì)胞以散在或擁擠的三維細(xì)胞團(tuán)排列，視覺立體感增強(qiáng)，細(xì)胞核清晰，核仁易識別（圖2、圖3）。

2.2 CS、LBC、BRAFV600E 基因檢測單獨(dú)或聯(lián)合檢測對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價(jià)值

CS檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為72.50%（29/40）、96.00%（48/50）、85.56%（77/90）；LBC檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為85.00%（34/40）、98.00%（49/50）、92.22%（83/90）；BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為67.50%（27/40）、100%（50/50）、85.56%（77/90）；LBC聯(lián)合BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為95.00%（38/40）、98.00%（49/50）、96.67%（87/90）。（表1、表2）

圖1 CS 檢測甲狀腺乳頭狀癌病理活檢結(jié)果（HE染色，×200）

圖2 LBC 檢測甲狀腺乳頭狀癌病理活檢結(jié)果（HE染色，×200）

圖3 LBC 顯示甲狀腺細(xì)胞核內(nèi)包涵體（HE染色，×400）

表1 CS和LBC單獨(dú)檢測甲狀腺乳頭狀癌的結(jié)果與病理診斷結(jié)果的對照

表2 BRAF V600E基因單獨(dú)檢測及LBC聯(lián)合BRAF V600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的結(jié)果與病理診斷結(jié)果的對照

3 討論

目前，F(xiàn)NAC在國外已成為評估甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的常規(guī)檢查手段，臨床應(yīng)用呈現(xiàn)逐年遞增趨勢[7]。王丹[8]研究分析甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷準(zhǔn)確度分別為96.67%、89.74%、87.8%、92.7%、92.7%，表明FNAC是術(shù)前診斷甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的可靠方法。FNAC穿刺后行CS，由于穿刺針上細(xì)胞沒有完全涂在玻片上，部分細(xì)胞隨穿刺針丟棄；人為因素致涂片過厚、涂片不均勻，或涂片過程中細(xì)胞過度風(fēng)干[9]；穿刺結(jié)節(jié)血供豐富，使穿刺針中紅細(xì)胞或膠質(zhì)過多，嚴(yán)重稀釋濾泡細(xì)胞，以上等因素均可使涂片不滿意，導(dǎo)致診斷效能下降。因此，解決CS不滿意的方法之一是細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師床邊快速制片、閱片或檢測涂片的質(zhì)量，但這需耗費(fèi)病理科大量人力，實(shí)施難度大。而LBC檢測將穿刺標(biāo)本沖洗至細(xì)胞保存液中，多次振蕩離心后，去除標(biāo)本中血細(xì)胞、膠質(zhì)、細(xì)胞碎片等干擾成分，液基自動制片儀器制片，將濃縮細(xì)胞及診斷成分黏附于載玻片上約直徑13 mm范圍內(nèi)，可以提高診斷效能[10-11]。LBC最早應(yīng)用于婦科宮頸疾病診斷，并得到了充分肯定；近年LBC也廣泛應(yīng)用于非婦科疾病領(lǐng)域，如胸腹腔積液、心包積液、痰標(biāo)本、支氣管鏡刷洗[11-12]，在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中也取得了良好的效果。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LBC與CS兩種方法診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的診斷效能分別為94.44%～97.50%和85.56%～90.45%[13]。本研究結(jié)果顯示，CS檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為72.50%、96.00%、85.56%；LBC檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為85.00%、98.00%、92.22%；LBC對甲狀腺乳頭狀癌的診斷效能均較高，有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。但LBC制片過程中存在振蕩、離心會引起細(xì)胞簇的分散，出現(xiàn)大量單個(gè)細(xì)胞，且對細(xì)胞質(zhì)有一定影響，導(dǎo)致核質(zhì)比例增大，出現(xiàn)大量裸核，影響了診斷準(zhǔn)確度[1]。

BRAF基因突變在甲狀腺乳頭狀癌中極為常見[14]。BRAF基因可將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，引起一系列細(xì)胞反應(yīng)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等功能[14-16]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，BRAFV600E突變在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺未分化癌中檢出率分別為29%～83%、10%～24%[17]，本研究結(jié)果顯示，BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌靈敏度和準(zhǔn)確度分別為67.50%和85.56%，與黃美玲等[18]研究結(jié)果相似。BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的特異度為100%，因?yàn)樵谡＜谞钕俳M織、良性結(jié)節(jié)、濾泡性腺癌及髓樣癌中均未能檢測到BRAFV600E突變[19]。LBC聯(lián)合BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為95.00%、98.00%、96.67%，提高了BRAFV600E基因單獨(dú)檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度和準(zhǔn)確度，值得推廣使用。甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E基因突變可以作為甲狀腺乳頭狀癌的高危因素及獨(dú)立的預(yù)后因子[20]。Lee等[21]通過Meta分析顯示BRAFV600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌組織侵襲力高，易向甲狀腺外浸潤、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床病理分期更高。

綜上所述，LBC技術(shù)對診斷甲狀腺乳頭狀癌具有良好的準(zhǔn)確度和特異度，BRAFV600E基因檢測診斷具有高特異度，兩者聯(lián)合使用，能進(jìn)一步提高術(shù)前對甲狀腺乳頭狀癌診斷準(zhǔn)確度，指導(dǎo)臨床治療，并且兩者檢測操作可行性強(qiáng)、創(chuàng)傷小，臨床上值得推廣應(yīng)用。