強(qiáng)肌健力方對(duì)重癥肌無(wú)力大鼠Th17∕Treg平衡的影響

方學(xué)君,梁藝,劉曉曼,譚梅傲,曹敏,趙利娜

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

重癥肌無(wú)力（myasthenia gravis，MG）是一種由于喪失功能受體導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)傳遞的缺陷，從而導(dǎo)致自發(fā)性肌無(wú)力和肌疲勞的神經(jīng)自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)的“痿病”范疇。MG具有病情重、死亡率高、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，是世界性難治疾病之一。臨床中，西醫(yī)學(xué)主要應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、血漿置換法、胸腺切除術(shù)等療法治療，但副作用多，療效欠理想，故尋求安全、有效的治療手段是亟待解決的問(wèn)題。國(guó)醫(yī)大師鄧鐵濤教授根據(jù)“脾主肌肉”理論和“脾胃虛損，五臟相關(guān)”學(xué)說(shuō)，運(yùn)用健脾益氣法治療該病，在提高臨床療效、減輕激素的依賴性及減少患者的復(fù)發(fā)率方面存在一定優(yōu)勢(shì)。健脾益氣法代表方強(qiáng)肌健力方在臨床上取得了良好的療效，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，該方能有效治療脾胃氣虛型MG[1-5]，減緩乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）的降解，增加有效AchR數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[6]。強(qiáng)肌健力方雖臨床療效確切，但其作用機(jī)理尚不明確。有研究表明，輔助性T細(xì)胞17型細(xì)胞（T helper cell 17，Th17）在MG發(fā)病過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cell，Treg）能抑制其功能。因此，本研究擬觀察不同劑量強(qiáng)肌健力方灌胃前后MG大鼠體質(zhì)量及肌力變化，同時(shí)采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)不同劑量強(qiáng)肌健力方灌胃后MG大鼠脾臟Th17細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄蛋白維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）、相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17A（IL-17A），Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白p3（Foxp3）及其轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）蛋白表達(dá)水平，以探討強(qiáng)肌健力方能否通過(guò)影響MG大鼠Th17、Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)二者平衡，從而對(duì)MG大鼠產(chǎn)生治療作用，并明確其量—效關(guān)系，以期從免疫學(xué)方面為中醫(yī)藥治療MG的臨床研究提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡Lewis雌鼠共70只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011]。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別動(dòng)物房中[許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0001]，自由進(jìn)食、飲水，保持恒溫22℃，濕度55%，晝夜節(jié)律。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 強(qiáng)肌健力方中黃芪、五爪龍、熟黨參、生白術(shù)、當(dāng)歸、廣升麻、北柴胡、蒸陳皮、甘草等中藥飲片均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.3 主要試劑與儀器 鼠源性AchR-α亞單位97-116肽段（杭州中肽生化有限公司）；完全弗氏佐劑（CFA）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：F5506）、不完全弗氏佐劑（IFA）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：F5881）。鼠源性多克隆RORγt抗體（美國(guó)Novus公司，批號(hào)：NBP2-24449）；Foxp3抗體（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab22510）；IL-17A抗體（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)：DF6127）；TGF-β抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab170874）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab6721）；BCA試劑盒（美國(guó)Pierce公司，批號(hào)：23227）；電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：WBKLS0500）。BL-420S生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（成都泰盟公司）；Mini-PROREAN3垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.4 造模與分組 將70只Lewis雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)選取7只作為正常組，其余63只參照許文華等[7]的造模方法進(jìn)行造模：首次免疫當(dāng)天視為0天，將鼠源性AchR-α亞單位97-116肽段、完全弗氏佐劑（CFA）和磷酸鹽緩沖液（PBS）按照1∶1∶1比例經(jīng)振蕩器混勻成乳化劑。水合氯醛按照1∶10的比例配成100 g∕L質(zhì)量濃度，按0.3 mL∕kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠后，取200 μL乳化劑分別注射于脊柱兩側(cè)及雙側(cè)后足墊皮下（含多肽100 μg）；第2次加強(qiáng)免疫于首次免疫后第4周末進(jìn)行，多肽、不完全弗氏佐劑（IFA）和PBS按照1∶2∶2比例混勻乳化后于相同部位皮下注射（含多肽50 μg）；首次免疫后第6周末進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫，其注射方法及劑量同第2次加強(qiáng)免疫。第3次加強(qiáng)免疫結(jié)束后1周（首次免疫第7周）評(píng)估造模。造模成功評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：①出現(xiàn)肢體乏力癥狀；②Lennon評(píng)分≥1分；③低頻重復(fù)電刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）[RNS=（第1波波幅-第5波波幅）∕第1波波幅×100%]≥10%。再將成模的Lewis大鼠隨機(jī)分為模型組（N=7），強(qiáng)肌健力方高劑量組（N=8）、中劑量組（N=7）、低劑量組（N=8）。

1.5 給藥方法 各組灌胃液體積為10 mL∕kg（體質(zhì)量），其濃度及等效劑量按成人體質(zhì)量折算[8]。首次免疫后第8周，強(qiáng)肌健力方高、中、低劑量組開(kāi)始分別給予大鼠強(qiáng)肌健力方（劑量分別為23.4、15.6、7.8 g·kg-1·d-1）灌胃，正常組和模型組予相同體積生理鹽水灌胃。1次∕日，療程為4周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 體質(zhì)量及肌力 稱體質(zhì)量及肌力評(píng)估于實(shí)驗(yàn)前及接種免疫后（每周2次）進(jìn)行。以Lennon評(píng)分作為肌力評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于肌無(wú)力臨床體征表現(xiàn)不明顯的大鼠，重復(fù)抓握籠頂1 min后再評(píng)估。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]為：0分，無(wú)任何臨床體征；1分，檢測(cè)前無(wú)臨床體征，運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)疲乏無(wú)力癥狀；2分，檢測(cè)前即出現(xiàn)肌無(wú)力體征，如蜷縮、抓握及抬頸無(wú)力；3分，無(wú)力抓握和行走、活動(dòng)；4分，瀕死狀態(tài)。介于兩者之間的以0.5、1.5、2.5、3.5分評(píng)定。

1.6.2 Western blot法檢測(cè)大鼠脾臟組織RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白表達(dá)水平 取各組大鼠脾臟組織100 mg樣品充分研磨，加入組織裂解液RIPA冰上裂解 30 min后，14 000 r∕m離心15 min，收集上清提取組織蛋白，參照二喹啉甲酸（BCA）試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定組織總蛋白濃度。各孔取40 μg的蛋白上樣，經(jīng)100 g∕L聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉2 h。TBST溶液共洗膜6次，5 min∕次，加入經(jīng)稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜3次，10 min∕次，加入稀釋后的二抗，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后，室溫下浸泡于TBST溶液中置于脫色搖床上洗2次，10 min∕次。根據(jù)ECL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行顯影。采用Image J圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 造模過(guò)程中，造模組大鼠因麻醉過(guò)度低體溫死亡3只，最終成模30只，成模率約50%。其原因可能為誘導(dǎo)免疫的乳化劑中未額外添加具有增強(qiáng)免疫作用的HR37a凍干粉，免疫原性較弱所致。另外，灌胃過(guò)程中因誤灌入肺，強(qiáng)肌健力方高、低劑量組各死亡1只。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量及肌力比較 圖1、2結(jié)果顯示：造模前，各組大鼠體質(zhì)量相近，肌力正常。造模過(guò)程中，正常組大鼠體質(zhì)量呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)且肌力正常，造模大鼠體質(zhì)量增速較為緩慢，逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、叫聲及抓握力減弱及動(dòng)作遲鈍等癥狀，特別是第3次免疫過(guò)后，各造模組大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)下降，肌無(wú)力癥狀明顯加重。首次免疫后第8周開(kāi)始灌胃給藥后，模型組體質(zhì)量及肌力繼續(xù)下降，各中藥劑量組大鼠體質(zhì)量開(kāi)始逐漸上升，Lennon評(píng)分開(kāi)始下降。給藥4周結(jié)束后，與模型組比較，強(qiáng)肌健力方各劑量組均能有效增加MG大鼠體質(zhì)量（P＜0.05），降低Lennon評(píng)分（P＜0.01），且各給藥組MG大鼠體質(zhì)量及肌力改善程度與灌胃中藥劑量呈正相關(guān)。

2.3 各組大鼠脾臟RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β表達(dá)比較 圖3、表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠脾臟RORγt、IL-17A蛋白表達(dá)水平均明顯升高，F(xiàn)oxp3、TGF-β蛋白表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，強(qiáng)肌健力方各劑量組大鼠脾臟RORγt、IL-17A蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01），F(xiàn)oxp3（低劑量組除外）、TGF-β蛋白表達(dá)水平均明顯上升（P＜0.05）；且強(qiáng)肌健力方各劑量組對(duì)MG大鼠脾臟RORγt、IL-17A、Foxp3、TGF-β蛋白表達(dá)的作用在量—效關(guān)系上呈正相關(guān)。表明強(qiáng)肌健力方能夠抑制MG大鼠脾臟Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄蛋白R(shí)ORγt及細(xì)胞因子IL-17A的表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄蛋白Foxp3及細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)，且其作用與藥物劑量呈正相關(guān)。

圖1 大鼠體質(zhì)量趨勢(shì)Figure 1 The trend of body mass in rats

圖2 Lennon評(píng)分趨勢(shì)圖Figure 2 The trend of Lennon scores in various groups

圖3 各組大鼠脾臟RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白電泳條帶圖Figure 3 The graph of electrophoresis bands of RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A and TGF-β proteins in rat spleen tissues of various groups

表1 各組大鼠RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)Table 1 Comparison of the relative expression levels of RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A and TGF-β proteins in rat spleen tissues of various groups （，p）

表1 各組大鼠RORγt、Foxp3、IL-17A、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)Table 1 Comparison of the relative expression levels of RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A and TGF-β proteins in rat spleen tissues of various groups （，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

分組正常組模型組強(qiáng)肌健力方高劑量組強(qiáng)肌健力方中劑量組強(qiáng)肌健力方低劑量組TGF-β∕GAPDH 1.087±0.040 0.343±0.025②0.933±0.021③0.727±0.050③0.500±0.017③N7 7 7 7 7 RORγt∕GAPDH 0.357±0.095 1.168±0.148①0.393±0.143④0.675±0.121④0.820±0.121④Foxp3∕GAPDH 1.060±0.206 0.437±0.101①0.962±0.135③0.737±0.253③0.485±0.127 IL-17A∕GAPDH 0.260±0.087 1.123±0.015②0.493±0.042④0.703±0.015④0.873±0.025④

3 討論

鄧鐵濤教授認(rèn)為，MG病機(jī)根本在于脾胃，脾虛則氣血生化無(wú)力，氣血不足無(wú)以濡養(yǎng)肌肉四肢則導(dǎo)致肌肉無(wú)力。強(qiáng)肌健力方全方以補(bǔ)氣健脾、益氣升陷為法，使肌肉得以充養(yǎng)，下垂之證得以緩解，從而改善MG的肌無(wú)力癥狀。本研究觀察強(qiáng)肌健力方對(duì)MG大鼠體質(zhì)量及肌力的影響，結(jié)果顯示，首次免疫后第8周開(kāi)始給藥前，正常組體質(zhì)量均明顯高于各造模組，而Lennon評(píng)分則明顯低于各造模組。結(jié)束4周給藥后，強(qiáng)肌健力方不同劑量組大鼠體質(zhì)量與模型組比較均明顯升高，Lennon評(píng)分明顯降低，且其升高及下降幅度隨中藥給藥劑量逐漸加大。表明強(qiáng)肌健力方能夠有效提高M(jìn)G大鼠的體質(zhì)量及肌力，且量—效關(guān)系呈正相關(guān)。

既往認(rèn)為，MG的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制與Th1∕Th2型細(xì)胞因子失衡導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多自身免疫性抗體有關(guān)，這一理論機(jī)制一直占主導(dǎo)地位[10]。近期研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞參與了Th1∕Th2型細(xì)胞因子的失衡，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多自身免疫性抗體，導(dǎo)致免疫紊亂，從而促使MG的發(fā)生[11]，而Th17細(xì)胞的免疫學(xué)功能受Treg細(xì)胞功能的限制。

Th17細(xì)胞作為CD4+T淋巴細(xì)胞亞群中的一個(gè)重要亞群，特異性表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子RORγt，分泌細(xì)胞因子IL-17、IL-23，參與促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展。臨床及動(dòng)物研究均表明，Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子，尤其是IL-17，具有促進(jìn)MG發(fā)病的作用，MG患者外周血及胸腺的Th17細(xì)胞增多，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]；而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Th17細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17促進(jìn)AchR-ab IgG2b表達(dá)和誘導(dǎo)B細(xì)胞耐受的缺失，進(jìn)而增加AChR-Ab的產(chǎn)生[13]。Treg細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，分泌細(xì)胞因子TGF-β、IL-10，具有維持自身免疫耐受的作用。Treg細(xì)胞的功能異常在自身免疫性MG的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用，其主要原因?yàn)镕oxp3表達(dá)缺失，影響Treg細(xì)胞發(fā)育及功能的發(fā)揮，且Foxp3的缺失程度與MG的嚴(yán)重程度相關(guān)[11，14]。研究表明，F(xiàn)oxp3能夠通過(guò)直接作用于RORγt抑制Th17細(xì)胞的產(chǎn)生[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與模型組比較，強(qiáng)肌健力方各劑量組均能有效提高Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3蛋白表達(dá)水平，降低Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt蛋白表達(dá)水平，推測(cè)強(qiáng)肌健力方可能通過(guò)促進(jìn)Foxp3的表達(dá)，同時(shí)抑制RORγt的表達(dá)，影響Th17及Treg細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)二者的平衡對(duì)MG大鼠產(chǎn)生治療作用。

相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，初始CD4+T淋巴細(xì)胞在TGF-β單獨(dú)存在的情況下向Treg細(xì)胞分化，在炎癥因子IL-6及少量TGF-β共同存在情況下則向Th17分化，且Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-21可以抑制Treg細(xì)胞的分化[16，17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，強(qiáng)肌健力方各劑量組與模型組比較能夠不同程度降低細(xì)胞因子IL-17蛋白表達(dá)水平，提高細(xì)胞因子TGF-β蛋白表達(dá)水平，故推測(cè)強(qiáng)肌健力方可能通過(guò)影響Th17及Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)二者的分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、TGF-β的表達(dá)，而IL-17表達(dá)的抑制及TGF-β表達(dá)的增加在促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化的同時(shí)又抑制其向Th17細(xì)胞分化，因此對(duì)MG大鼠產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，強(qiáng)肌健力方能夠有效提高M(jìn)G大鼠的體質(zhì)量及肌力，緩解病情，抑制Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄蛋白R(shí)ORγt及細(xì)胞因子IL-17A的表達(dá)及促進(jìn)Treg細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄蛋白Foxp3及細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)。推測(cè)強(qiáng)肌腱力方對(duì)MG大鼠的治療作用可能是通過(guò)影響Th17、Treg細(xì)胞的分化及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)二者平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而其具體的作用通路有待進(jìn)一步研究闡明。