六味地黃丸通過調控NF-κB及TGF-β∕Smad 雙信號通路減輕糖尿病腎病炎癥及纖維化

陶鵬宇,張悅

（上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病進展到后期出現(xiàn)的一種嚴重并發(fā)癥，也是導致終末期腎病的重要原因[1]。葡萄糖代謝異常引起的腎小球毛細血管和腎小管結構功能的改變在糖尿病腎病中起重要作用[2]。糖尿病腎病以腎臟纖維化為主要形態(tài)學特征。腎小球細胞外基質生成增多并沉淀在基底膜上導致基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管間質纖維化，會進一步加重糖尿病腎病[3]。炎癥在DN中的作用受到廣泛重視，核因子κB（NF-κB）炎癥通路的激活可使多種促炎癥因子的表達增加從而介導炎癥活動，同時也引起轉化生長因子（TGF）-β∕Smad通路激活促進腎臟纖維化發(fā)生，這提示炎癥和纖維化在DN中相互作用，可進一步惡化病情[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸可以延緩大鼠糖尿病腎病進展，保護腎臟功能，其機制可能與抑制TGF-β1-Smad信號通路相關[5]?；诖耍狙芯繑M從NF-κB與TGF-β∕Smad雙信號通路角度進一步探討六味地黃丸在糖尿病腎病中的抗炎抗纖維化作用，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級雄性SD大鼠30只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室內溫度為25℃，自由進食普通標準飼料和飲用純凈水。

1.2 藥物與試劑 六味地黃丸濃縮丸（購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號：807063）。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，購于美國Sigma公司，批號：119K1591）；BCA蛋白定量試劑盒（購于碧云天生物技術有限公司）；NF-κB、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、alpha平滑肌抗體（α-SMA）、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等抗體（購于美國CST公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔Ⅱ抗，HRP標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗（購于晶美生物工程有限公司）；PVDF膜（購于美國Millipore公司）。

1.3 儀器 強生穩(wěn)步型血糖測試儀（強生中國有限公司）；PowerWave XS2酶標儀（美國BioTek公司）；電泳裝置（美國BioRad公司）；Axio Lab A1型正置顯微鏡（德國Zeiss公司）；Fluorochem M型自動成像分析系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）。

1.4 分組、造模與給藥 動物適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分成正常組、模型組、中藥組，每組10只。于造模前1 d禁食24 h，將STZ溶于pH 4.5的0.1 mol∕L檸檬酸鹽緩沖液，避光保存，給造模大鼠（20只）按60 mg∕kg一次性腹腔注射STZ，正常組（10只）則注射等量檸檬酸鹽緩沖液。造模1周后，尾靜脈取血測量大鼠空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG＞16.7 mmol∕L為糖尿病大鼠[6]。將六味地黃丸按人與大鼠體表面積比折算成等效劑量（6.75 g·kg-1·d-1）[5]灌胃，正常組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)12周。

1.5 標本收集 取材前1 d撤掉飼料只保留飲用水，代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，以100 g∕L水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，-80℃保存；取雙側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱質量，取腎臟的一部分組織浸泡于福爾馬林中用于石蠟切片，取體積大小適中的腎組織包裹于錫紙中并置于液氮中，繼而放入-80℃冰箱保存，用于組織勻漿以作其他生化實驗用途。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 一般情況觀察 觀察大鼠精神活動狀態(tài)、毛發(fā)顏色和密度、食物消耗程度。

1.6.2 腎系數(shù)的測定 將大鼠麻醉后處死，迅速剖腹取兩側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱質量。腎系數(shù)（w∕%）=雙側腎質量（m∕g）∕體質量（m∕kg）×100%。

1.6.3 生化指標檢測 采用全自動生化儀檢測各組大鼠24 h尿蛋白總量（24h-Pro）、血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、FBG。

1.6.4 腎臟病理形態(tài)學觀察 ①蘇木素—伊紅（HE）染色：取腎皮質，體積分數(shù)10%中性福爾馬林固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm石蠟切片，HE染色后光鏡觀察。②Masson染色：脫蠟至水，bouin液60℃恒溫箱固定1 h，沖洗后蘇木素染色10 min，Masson復合液染色20 min，沖洗后加5%磷鉬酸分化6 min；倒掉磷鉬酸加入2%苯胺藍復染7 min，2%冰醋酸分化2 min，乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂固定，然后鏡下觀察。

1.6.5 Western blot法檢測腎組織NF-κB、MCP-1、α-SMA、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表達 取適量腎臟組織，放入含有預冷RIPA裂解緩沖液的試管中，于冰上用超聲破碎儀勻漿，離心取上清，即為組織蛋白液。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行定量，將各組蛋白濃度調至一致，加入loading buffer煮沸蛋白變性，結束后保存于-80℃冰箱。取出變性好的組織樣品于冰上溶解、震蕩、離心后上樣，每孔加10 μL蛋白樣品電泳，積層膠電壓80 V，分離膠電壓110 V，經過電泳、轉膜、封閉、TBST洗滌、一抗[分別為 NF-κB、MCP-1、α-SMA、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7（稀釋比均為1∶1 000），GAPDH（稀釋比均為1∶5 000）]孵育、TBST洗滌、二抗孵育、TBST洗滌、添加顯影液、機器下曝光條帶等步驟。以Image J測定目的條帶∕內參的灰度值比值（p）來反應蛋白表達變化。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 正常組大鼠毛色光亮，無脫發(fā)，活動自如；模型組大鼠明顯瘦小，毛較粗糙，色澤黯淡，食物及水消耗較正常的多，喜靜少動；經六味地黃丸治療后，上述癥狀有所改善。

表1結果顯示：與正常組比較，模型組體質量減少，食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)增加（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組體質量增加，食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)減少（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血糖及腎功能比較 表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FBG、SCr、BUN及24h-Pro顯著提高（P＜0.01）；經六味地黃丸干預治療后，上述指標均有所改善（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量、食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)變化Table 1 Comparison of the changes of body mass，consumption of food and water，output of urine and rend coefficient in various groups （）

表1 各組大鼠體質量、食量、飲水量、尿量及腎系數(shù)變化Table 1 Comparison of the changes of body mass，consumption of food and water，output of urine and rend coefficient in various groups （）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

分組正常組模型組中藥組腎系數(shù)(w∕%)5.60±1.23 15.67±3.31①12.88± 2.71①②N 10 10 10體質量（m∕g）478.34±11.81 325.61±10.32①366.47± 12.33①②24 h食物（m∕g）28.06±8.23 75.66±11.89①53.24± 9.07①②24 h飲水（V∕mL）45.12±15.03 216.75±36.89①150.35± 20.01①②24 h尿量（V∕mL）15±6.01 57±25.34①32± 20.01①②

表2 各組大鼠血糖及腎功能比較Table 2 Comparison of the changes of FBG and renal function in various groups （）

表2 各組大鼠血糖及腎功能比較Table 2 Comparison of the changes of FBG and renal function in various groups （）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

分組正常組模型組中藥組24h-Pro[ρ∕(mg·L-1)]5.6±3.5 80.7±20.3①63.2± 13.4①②N 10 10 10 FBG[c∕(mmol·L-1)]4.5±0.68 26.8±7.55①18.7± 5.66①②SCr[c∕(μmol·L-1)]16.2±1.43 28.9±7.92①21.4± 5.78①②BUN[c∕(mmol·L-1)]4.8±0.71 16.3±4.26①8.3± 2.40①②

2.3 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學改變 HE染色結果顯示：正常組腎組織形態(tài)正常，小球形態(tài)規(guī)則，無炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞形態(tài)正常；模型組大鼠腎小球體積增大、結節(jié)樣硬化，系膜基質增生；中藥組大鼠腎小球形態(tài)基本正常，系膜基質輕度增生，病變明顯輕于模型組。Msson染色結果顯示：正常組無明顯改變，各部分排列整齊；模型組腎小球部分體積變大兼纖維組織生成增多，間質增寬，球囊粘連；經六味地黃丸治療后，纖維化程度較模型組減輕，炎癥細胞浸潤減少。

圖1 各組腎臟組織病理形態(tài)學改變（HE，×400；Masson，×200）Figure 1 Comparison of the pathomorphologic changes of renal tissues in various groups（by HE staining，×400；by Masson staining，×200）

2.4 六味地黃丸對NF-κB、MCP-1蛋白表達的影響 圖2、表3結果顯示：與正常組比較，模型組中NF-κB、MCP-1表達水平均升高（P ＜0.01）；經六味地黃丸治療后，NF-κB、MCP-1表達水平均有所下降（P＜0.05）。

圖2 NF-κB、MCP-1蛋白電泳條帶Figure 2 Electrophoresis strips of NF-κB and MCP-1 proteins

表3 各組腎組織NF-κB、MCP-1蛋白表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of NF-κB and MCP-1 proteins in renal tissues of various groups （，p）

表3 各組腎組織NF-κB、MCP-1蛋白表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of NF-κB and MCP-1 proteins in renal tissues of various groups （，p）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組MCP-1∕GAPDH 0.17±0.02 0.76±0.08①0.47± 0.02①②N 10 10 10 NF-κB∕GAPDH 0.21±0.04 0.88±0.10①0.54± 0.30①②

2.5 六味地黃丸對TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達的影響 圖3、表4結果顯示：與正常組比較，模型組中的TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達升高，而Smad7表達下降（均P＜0.01）；經六味地黃丸治療后，TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達下降，而Smad7表達上升（均P ＜ 0.05）。

圖3TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白電泳條帶Figure 3 Electrophoresis strips of TGF-β，α-SMA，Smad2，Smad3 and Smad7 proteins in various groups

表4 各組TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達比較Table 4 Comparison of the expression levels of TGF-β，α-SMA，Smad2，Smad3 and Smad7 proteins in renal tissues of various groups （，p）

表4 各組TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達比較Table 4 Comparison of the expression levels of TGF-β，α-SMA，Smad2，Smad3 and Smad7 proteins in renal tissues of various groups （，p）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組Smad7∕GAPDH 0.78±0.29 0.17± 0.17①②0.49± 0.34①②N 10 10 10 TGF-β∕GAPDH 0.17±0.11 0.89±0.67①0.51± 0.44①②α-SMA∕GAPDH 0.18±0.21 0.91±0.75①0.62± 0.56①②Smad2∕GAPDH 0.26±0.22 0.90±0.57①0.54± 0.34①②Smad3∕GAPDH 0.14±0.12 0.85± 0.45①②0.56± 0.23①②

3 討論

糖尿病腎?。―N）是1型或2型糖尿病患者的主要并發(fā)癥，也是終末期腎功能衰竭的主要原因之一[1]。DN臨床病理特征是微量白蛋白尿、細胞外基質（ECM）蛋白過度積聚、基底膜增厚，最終導致腎功能衰竭[2]。

纖維化是在機體受到損傷時為維持原組織結構和功能的完整性而對傷口進行修復和愈合的一個過程，α-SMA是成肌纖維細胞的標記物[7]。有研究表明，炎癥在糖尿病腎病纖維化中起著重要作用，炎癥細胞如中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞等對腎小球和腎小管間質浸潤[8]。NF-κB信號通路是介導DN發(fā)展過程中腎臟炎癥的重要組成部分。通過激活NF-κB信號通路，導致一系列促炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8活化進入到腎臟部位刺激誘導腎小管上皮細胞表型轉變?yōu)殚g充質細胞產生大量ECM蛋白，積聚并沉積在腎間質促進腎纖維化形成[9]。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）是趨化性細胞因子家族中的重要成員之一，腎間質損傷時腎小管上皮細胞會產生大量的MCP-1，其在腎小球硬化、腎間質炎癥損傷、腎間質纖維化中起關鍵作用[10]。Vielhauer等[11]在UUO鼠中發(fā)現(xiàn)MCP-1在腎小管上皮細胞及間質細胞大量表達，MCP-1可通過對單核∕巨噬細胞的趨化引發(fā)間質炎癥。因此，通過抑制炎癥反應具有抑制進行性腎纖維化潛在治療靶點的作用。

TGF-β在臨床腎臟纖維化疾病及實驗動物模型中均存在著高表達，提示TGF-β在腎臟纖維化的發(fā)病機制中起著重要的調控作用[2，3]。TGF-β刺激ECM生成的同時又抑制其降解，促腎纖維化形成。此外，TGF-β1亦可通過上皮—間質轉化（EMT）這一機制誘導腎小管上皮細胞轉化成肌成纖維細胞來介導腎纖維化[12]。TGF-β是DN腎纖維化的重要介質，研究報道提示TGF-β可能通過Smad信號通路發(fā)揮其作用[13]。在糖尿病條件下，某些細胞因子通過激活TGF-β∕Smad信號通路，刺激膠原蛋白基質沉積并促進腎小管間質和腎小球纖維化[14]。而有研究報道，使用TGF-β受體抑制劑雖然可以抑制TGF-β的活性并在一些糖尿病腎病動物模型中可以改善腎小球硬化，但是僅僅抑制TGF-β可能會帶來一些負面效應，如刺激腎臟炎癥反應[15]。因此，有必要尋求一種抑制TGF-β兼控制炎癥損傷的方法。

中醫(yī)藥在我國有著廣泛用于糖尿病治療的歷史，并被公認為傳統(tǒng)醫(yī)學的有效補充。糖尿病屬于中醫(yī)的“消渴”范疇，其發(fā)病機制為虛火上炎，灼傷陰液，下?lián)p腎水，導致腎陰虧虛[16]。六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，具有滋陰補腎功效，對臨床治療糖尿病具有輔助效果[17]。本研究以STZ誘導的DN大鼠模型為研究對象，觀察六味地黃丸的治療效果，結果發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可降低DN大鼠血糖，減少尿白蛋白排泄，改善體質量，減少多飲多食癥狀，降低SCr并緩解腎小球系膜基質擴張和腎小球基底增厚。表明六味地黃丸具有顯著的腎保護作用。

本研究結果亦顯示，模型組中TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達明顯上調，而Smad7受到抑制，而中藥組TGF-β、α-SMA、Smad2、Smad3表達受到抑制，Smad7的表達增加，表明六味地黃丸可能通過抑制TGF-β∕Smad通路從而抑制腎纖維化的進程。另外，前面所述抑制TGF-β介導的纖維化同時也會刺激炎癥反應，本研究結果顯示，模型組NF-κB、MCP-1表達明顯上調，而六味地黃丸治療可有效地降低NF-κB、MCP-1表達，提示六味地黃丸可以降低相關炎癥因子表達，抑制NF-κB信號通路，減輕腎臟炎癥。那么，推測六味地黃丸的抗炎作用或許是緩解腎臟纖維化的另一個重要機制。

綜上所述，六味地黃丸可抑制糖尿病腎病的腎纖維化、減輕腎臟炎癥損傷，其機制可能與抑制NF-κB和TGF-β∕Smad雙信號通路有關。